Способ получения двойных солей -аденозил-метионина

иоритет94 А/7348 А/74убликовано осударственнын комнтеСовета Инннстроа СССРпо делам изобретенийн открытий(72) Автор изобретения Остранецерто ФизккИталия) Иностранная фирма Эррекаппа Эуротерапичи С.а,С,(Италия)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНЦ.; ДВО;.Ъ 1-.;Х СОЛ тт Я - АДЕЯОЗИЛ -- МЕ. .",.1."Ю: т.п Изобретение относится к способу получения новых стабильных солей Я.аденозилметионина (ЗАМ), являющихся основой для получения ценных фармацевтических препаратов с широким спектром действия. Известен способ получения различных солей ВАМ, в частности галоидидов ВАМ, таких как бромид, хлорид, йодиц, основанный на том, что готовят раство с достаточно высокой концентрацией ЯАМ, осажда. ют ЗАМ, например, с помощью фосфорновольфрамовой кислоты, выделенный осадок растворяют в подходящем растворителе и подвергают взаимодействию с тетраэтиламмонийгалоидидом, получен. ную соль ЗАМ вьщеляют известными приемами. Однако известные соли ЯАМ (галоидиды, сульфаты) даже в сухом состоянии представляют собой крайне нестойкие соединения при окружающих температурах и тем более при температурах, пре. вышаюших окружающие, Кроме того, способы получения этих солей весьма трудоемки, пригодны для получения лишь небольших количеств и не могут быть осуществлены в промышленном масштабе; выход целевого продукта достаточно низкий и обычно не превьнпает 10%,В литератур отсутствуют какие-либо сведения1 получешш солей ЯАМ, стабильных при нормальных условиях температуры и влажности, Такие соли ЯАМ представляют значительный интерес для 5 бттохимип и фаРкологии.Стлсывают способ получения новых двойныхсолей ЗА 5 ч и - толуолсульфокислотой и серной кислотой, обладаюнотх высокой стабильностью воовремени и при температурах вплоть до 45 С, ОСпособ заключается в том, что а) готовятконцентр 1;рова 1 ный раствор либо путции нз природных веществ, которые содлибо путем энзиматического синтеза итрифосфата (А 1 Ф) и ьатионина; б) ВАМ, при 5 сутствуюший в водном растворе, ос жцаю рипомощи насыщенного водного раствора пикролоновой кислоты или растворами этой кислоты в органических растворителях, растворимых в воде, таких как метиловый, этиловый пропиловый, О ц-бутиловьтй или изобутиловый спирты, ацетон,метилзтилкетон, метилизобутилкетон, этилацетат, тетрагидрофуран, 2-метоксиэтанол, 2-этоксиэтанол, диоксан или диметилформамид; в) пикролонат ЯАМ растворяют в смеси, состоящей из равных 5 объемньд частей водного раствора одинаковыхнормальностей и . Топуолсульфо," .кислоты и органического раствор;,геня, части гносме шива югцегося с водой, такого к; . .1 с. ВнэтЫкетон, метшп 1 зобутинкетон, я - бутиловын илиизобутиловьгй спирт; г) соль ЯАм осаждают иэводного слоя растворителем,. полностью растворимым в воде, таким как кс гоп или спирт; д) соль,выпавшую в осадок, растворяют в 10.20%-помрастворе и - топуолсульфокислоты в метаноле иполученньш раствор Ооесцвечивают дреВеснымуглем; е) двойную соль ЯАМ с серной кислотой и птолуопсульфокислотой осаждают органическимрастворителем, таким как лифатический спирт с1.5 атомами углерода, диэтиповьш эфир,хнорофорлили тетрагидрофуран.Как уже было указано, стадия а) процессаможет быть осущестВлепа одинаково эффективнсразличными способами,Согласно изобретению, один вариант стадии а)заключается в том, что дрожжи ( ЯассЬаговусекСегеоЫа, Тогоорв 1 з оТП 1 яСаидс 1 а цт) обога.щепные ЯАМ путем прибавления метионина в соотве тствуюнд 1 х условиях обрабатывают этилаце татоми затем 0,1-0,5 н, серной кислотой, предпочтительно0,35 н., при колпгатной температуре, чтобы вь 1 зватьлизис клеток и переход в раствор практически100% присутствующего ЯАМ,Коничесиа воды и этипацет га находятся винтервале 1:20 - 1;5 от веса влажных клеток иобработку проводят в течение 15 - 45 минпредпочтительно 30 мчн,Затем прибавляют серную кислоту и пизиспроводят в течение 1.2 ч, нрепОчтит".пьно 1,5 ч,Следует Отметить, что лизис клеток дрожжл, проводилгып с использованием смси О 1 эганическогорастворителя и разбавленной серной киснопяявляется значительно более удобным, чем Обыщкпровопиынй при помони хлорной, муравьиной,уксусной кислоты и т, и так кзк он не толькопротекает при окружающей температуре, что является весьма благоприятным для стабильности ЯАМ,но и ведется в таких условиях, что раствор можетбьть легко отфильтрован от клеточного остатка ине содержит каких. либо примесей, присутствующихобычно при использоважи других средств дляпроведения лизиса, которые трудно удалить приполучении чистого ЯАМ,Согласно второму варианту стадия а) получе.ния ЯАМ осуществляется под действием энзимаАТФ-метионинаденозилтрансферазы на инкубационную смесь, содержащую АТФ и метионин.Основным условием для промышленного осу.ществпения этого метода является то Обстоя.тельство, что энзим должен быть чистым и нахо.диться в такой форме, в которой его легко выде.лить как из начальной инкубационной смеси, так ииэ полученного ЯАМ.Очистку энзима Осуществляют хроматогра.фически путем перколяции раствора, содержащегоэнэим, например сырого экстракта дрожжей10 даря этому можно достигнуть разделение его и других белков и получить энзим в весьма чистой форме. 60 20 25 30 35 4045 50 бэнгом, с которым ковапентно связана группа, ведущая себя, как конкурирующий ингибигор дпя самого энзима. В качестве сорбента для такой очистительной колонны по изобре "с; . снопьзуот активпрованный гель потгисахар:.,. которым ковалентно связан 1 низин,Степень сродства энзима к остатку лизина, связанному с твердой матрицей, вызывает задержку в элюировании энзима из колонки и благо. Однако выделение энэима из содержащего его элюата для использования его на следующей стадии энзиматического синтеза нецелесообразно, так Как после такого выделения стабильность энзима низка, кроме того энзим после однократного его использования при синтезе ЯАМ разруниется при после. дующих Операциях выделения ЯАМ. Поэтому для получения наилучших результатов элюат, содержащий специфический энзим, вводят в колонку, заполненную твердым сорбентом, представлящим собой полисахарид, активированный реагентом, способным связывать белки с твердым сорбентом, таким, как цианиспай бром, Затем в этой колонне, содержащей специфический энзим на описанном твердом сорбенте, проводят каталитическую реак. цию между метионином и АТФ, ведущую к образованию ЯАМ, Обычно через колонку пропускают раствор АТФ и метионина в соответствующем бу. ферном растворе, получая эпюат, содержащий ЯАМ,Осаждение ЯАМ в кислой среде с помощью водного раствора пикропоновой кислоты или растворов ее в Органических растворителях, проводимое на стадии б), отличается простотой и мягки ми условиями, и, кроме того, позволяет получать ЯАМ высокой чистсты, что практически неосу. ществимо при применении других известных агентов осаждения, таких как пикриновач кислота, соль Рейнеке или борная кислста,На стадии в) используют расгворь, содержащие и - толуопсульфо кислоту и серную кислоту 0,05-0,2 н.предпочтительно 0,1 н., с применением органического растворителя, хорошо смешиваю. щегося с водой, такого как мметипэтипкетон или н-бутапоп. Приленение органического растворителя дает возможность употреблять си 1 пно разбавленные водные растворы и практически снужит дня уда. ленин всей пикрононовой киснотььНа стадии г) процесса предяочгитеньно используют 4-Зоб. (по Отнонению к обьему водного раствора) растворителя, такого как ацетон, метиловый, этиловый или пропиловый спирт.Большой интерес представляет тот факт, что в том случае, если на стадии П) используют мини. юльное количество метанола, трсбующегося дня растворителя осадка, образовавшегося на сталин г), то на следующей стадии е) осаждения выделяют двойную со ль ЯА М+Н Я О ; 11, Я О,рдии д) используют метащ л огестзе г.-,ШЕИ МЕРЕ ВДВОЕ тЗЕВЬШаЮШЕМ ИЕООХОПИМОЕ ТО Наследурщей стапи е) Осажпепгя выделяю-трой 1-.Осолэ 8 5 1104 Н 204 -113 С 61:48311 11ванне промежуточного кол-,че;тва метало-а ведут к об.разованию смеси двух солей.ГКонепсе Осал(цен 1 Р, стаДиЯ е), ОбрезовзвпейслдВОйНОЙ СОЛИ ВАМ трЕбуЕт рИМЕНЕаня О 1 тпаи.ческого растворителя, такого как метанол, пк.этиловый эфир, хлороформ, н - пропанол, изо. - ;рспанол, и бутанол, изобутанол, втор-бугпилсвыйспирт, изоамиловый спирт ии тетрагидрофуран.Двойные соли ЯАЧ могут храпться неопре.деленно долгое время в сухом состоянии и пракд.чески не изменяотся.15Предлагаемый способ отличается простоя, нетребует сложной и дорогостоящей ахшаратурн итаких методов, которые трудно осуществимы впромышленном масштабе; процесс осуществляетсяв кислой среде и ни на одной из стапий не треоуетприменения температур, превышаюших окружаю.щую.П р и м е о 1, 15, 90 кг дрожжей, обогащенньхЯАЧ (6,88 гкг 5, нрибазляьэт 11 л гтилацепз - га11 л воцы при Окр"жаюшей температуре,:.1 ослеэнергичного перемея.вам:1 в течение 33 - :.:1прибавляют 50 Л 0,351 ь : - ,р;ой,по;:;МЕПИВашт ЕПЕ В т-:,ЧЕЕ 1, .о . - .; - ,: - , - ,. - , Г,=,И ПРОМЬ 1 ВКИ ВООй, 51111 Ла 1 ОТжащего .т Щ г 1 БАЙ что сот - , ет - .3;:всего БА 111, присутсгвуюцегр и исход 1 оь:те риале,К ПОЛУЧЕ 1151 ОЫУ РаьтьбРУ П 1 ЗЦ ПЕР,Е 1 т ".ПЗприбавляют раствор 2,3 кг 1 икро 1 оного . ыв 25 л метилэти 1 кетона; госле выдеРжк;- в 1",:е 1-, - зчночи осадок отделяют путем пентриф-.з .о.1 н;я :промывают водой,Полученное таким образом твеэдоеприбавляют при пегемешпанин к с:.ес 1 сзсгс:-.Ое-.из 18 л 1,0 Н. раствора се 1.но кС,11с ульфокислоты 18 л ьет;1 зть е-:"лвыдержки органическую фазу от 1 еля:г и пода .т;.систему рекупераши пкролоновойводную фазу оорабатываот небольптим кон.,чеством метилзтилепкетона 5 ля удаления следовыхколичеств пкролоповой кислоты, прибавляютобесцвечиваюший древесинй уоль и затем фильт.Этот раствор 116,5. ) Содержт 33,8 г/л САМ,что соответствует 90" ,соелне:1 я, 1 рисутств,юхг,щего в дрожжах,Раствор вылваот в 100 л ацетона при пере. мешиваэ 1. После 111 пср"зи ж 3: - ь декан. тируют и твердое вешс.Лчо аьтсяют в ,3 кг 15%-ного паствора л.то. 1 О, ь 1 зокс-.оть в метаноле, После и р 1 5145 -."с с 1 31 лающего д 15 евссного угля сх 5 ссь 551 ьтр. Ют н прбавляют к 25 л лязглоло о 3115 ра При этом 11 з 11 схот ос 1;.Ле 1151 е 1184 г чсск 1 р 510 "- р" па ц в виде 60Ваьт: ".; - ЛВ:..Ь г 1 РОСКО 1 ТИЧНОй, ХОРОШО раст: - : 1.с;с: -.: .:.:.-. - ю) с образованием бесненс-а 1 с : Лппгь счегка растворяется в Стг ". т:, е, и н: растворяется в аде то., ",- -. ;,; ;:.-;, х:. о-,. О форме, высших спирт,:. о-;нз:3: ы, к т лз;с-:ржит каких либо р о1.зйдено,сс.3936; Ы 4.63 16,7; й 8,8.Сза 1453 ЬС 13,3 (молекулярньп вес 938,98)"гт; - ,е;." Г; .".".,; 11 4,51, М 8,95; В 17,0711 а 1 л -. 1,.: ..:. 20,5; 1 . толуолсульфокис 1 тот",6,0: "А: ;Вычис.че-ОЯ;- 80,; 20,89. п - толуолсуль.ф Окидтета 36 67 ; ,.1Влржность, О-, - :де-.люл доя по методу К.Фиш:, - .-аа, "-:.,;.;ср поглощения в ультрафиолетовой : . ст: .-:,Сзого соединения имеет максимум при 260 ьпьм Ес 5 - .82.Этн 1:1 нае по-:,-вержпают. что соединение опи- СЬВаетг ВО 55,лт111 аС 11 - СООН -- о ,д. ГИ 1 П 1 ос-Ованным на-" ,о" разовавш 1 йся осадокг-:тсг .л Обрабатывают 9 и ". , 3. -- :.:, - :5: к;1 лоты и л - толуолсуль.Со; ,-,;. - ,.-,:. - ,; ь ег, - .:.зоб.тилкетона. После ВЫДЕ РХ:К 1, . 1 аП-Е СКУЮ фаЗУ ОТГЕЛЯЮТ, ОСВ О.боишсяат вои: р фазу от зедов 11 кролоновой кслст 1 т 1 те" 1 "о"ывая ее метилззобутил.кетоном. 1 рибавляют Обесвечнвающий древесный.тго 1 ь с, алесь р:.,-ьтр;ют Фильтрат вьливают в 70 л ме илт рг:-: - "р-г г,"сле вь 5 всржки 1 эбразовав.ШЕЕСЯ ТВС",ПОЕ ВЕ ЕСТВО ОтДЕЛЯЮт ДЕКаНТ 5 нсй От раствортел:. ", р:.:.-воряют в 15% ном растворе л.толуо;тл;, "-,1;.-.;. 45 етг.ноле 11,65 кг), 11 ослебеж.",3 . - :,;: : -.;:.ьт тлем фильтрат приба - г.р .: 10 51 рмЬОрьа дчя полУчен 1 Я легко отфильтровываюп;егося кристаллического осадка ЯА 14 в форме дсу 1 ьфатпшаратолуолсульфоната.г 1 ОЛуЧЕ 5 Ый:рО;у ." 1,: 510 Г) Ласт Прл аяаЛИЗЕ реззль ать; ле 1-.;".ч;те., 5, О-О 1 ьг даст 111 э 11 к1 - п я В 5 р576922 1 О 15 20 25 30 35 45 50 55 7П р и м е р 3. Очистка специфического энзима.50 мл "сефарозы" (полисахарид, вьшускаемьй фирмой "Фармация Файн Кемикалз АВ - Упсала", Швеция) спеченного и суспендированного в воде, обрабатывают бромистым цианом в соответствии с хорошо известными методами связывания веществ, содержащих аминогруппы с матрицами, состоящими из полисахаридного геля. К приготовленному таким способом гелю прибавляют избыток 1.лизина, Материал после реакции последовательно промывают дистиллированной водой, буферным раствором с рН 8,5 и буферным раствором с рН 4,5, Затем этот гель используется для набивки колонки, диаметр которой составляет 1,5 сма высота 30 см. Через колонку до достижения полностью равно- веского состояния пропускают буферный раствор с рН 8,0, 0,05 М по триэтаноламину и 0,01 М по серной кислоте. Затем в колонку вносят 2 мл экстракта дрожжей, содержащего специфический энзим, полученного обработкой ультразвуком или гемогениэацией с твердой углекислотой и, , возможно после обогащения специфическим энзимом. Затем колонку элюируют той же буферной смесью, какая применялась для создания равновесного состояния, после черед распределение белков, присутствующих в элюате, контролируют проведением измерений в ультрафиолетовой области спектра. Одновременно определяют активность синтетазиса для различных фракций по методу Дж. А. Стекола 1. Те фракции, которые проявляют одинаковую активность синтетазиса, объединяют и полученный раствор показывает удельную активность по меньшей мере в 20 раз большую, чем у сырого экстракта. Энзим может быть после этого дополнительно концентрирован в данном растворе путем осаждения солями, органическими растворителями или в соответствии с дру. гимн известными методами концентрирования растворов белков.Получение ВАМ 30 мл спеченной сефарозы, представляющей собой гель, активируют бро мистым цианом или любым другим известным методом связывания белков с матрицами из поли. сахаридного геня, 4 мл раствора специфического энзима, очищенного, как зто было описано выше и содержащего примерно 100 мг белка, вносят в активированный гель. Суспензию активированного геля и раствора энзима перемешивают при 4 С в течение 18 ч, Смолу промывают водой. Эта про.мывная жидкость содержит. примерно 70% общей энэиматической активности, первоначально присутствовавшей в растворе специфического энзима.Путем инкубирования сефарозы, приготовленной, как это описано выше, с применением ранееф" описанного метода, служащего для определения активности синтетазиса, устанавливают, что 20% общей активности связано с полисахаридом.Сефароэа, приготовленная, как это описановыше, служит для набивки колонки, имеющей диаметр 1,5 см и высоту 20 см. Через колонку со скоростью 5 мп/ч при 25 - 27 С пропускают раст. 8вор 0,675 М по триэтаноламину, 0,150 М по суль.фату магния, 0,05 М по АТФ, 0,05 М по 1 метиони.ну, и 0,01 М по хлористому калию). После анализаэлюата из колонки на содержание ВАМ обнаруживают,что степень превращения составила 30%,Получение двойных солей ВАМ с серной ипаротолуолсульфокислотой. 103 мп элюата, содержащего 6 г/л ВАМ подкисляют серной кислотой до достижения величины рН, равной 3, и к этой жидкости прибавляют при перемешивании раствор 2,3 г пикролоновой кислоты в 25 мп метилэтилкетона. После выдержки в течение ночи, осадок отфильтровывают и промы. вают водой. Осадок снова растворяют в 18 мл 0,1 н. раствора серной кислоты и л.толуолсульфокислоты ч в 18 мл метилэтилкетона. После перемешивания и ввтдержки, органический слой отделяют и водный слой обрабатывают небольшим количеством метилэтилкетона дпя удаления последних следов пикролоновой кислоты, После отделения водного слоя прибавляют обесцвечивающий древесный уголь и смесь фильтруют. При этом получают 16,5 мл водного бесцветного раствора, содержащего 33,8 г/л ВАМ, что эквивалентно 90% ВАМ, присутствовавшего в исходном растворе. Методом тонкослойной хроматографии устанавливают, что раствор содержит только ВАМ. 16,5 мп раствора выливают в 100 мп ацетона, После перемешивания и выдержки жидкость декантируют. Твердое вещество растворяют в 6,6 г 15%-ного раствора л .толуолсульфокислоты в мтаноле, После прибавления обесцвечивающего древесного утля и фильтрования раствор выливают в 25 мл диэтилового эфира. После выдержки еге фильтруют и получают хорошо сформированные кристаллы соли, весящие 0,967 г и имеющие следующии состав. ВАМН 804 с Нз 804 СНзС 6 Н 4 ВОзННайдено,%: С 33,68; Н 4,65; 1 ч 108; 8 16,5;ВАМ+ 50,5, НО 2,1; К 8025,3, л-толуолсуль.фокислота 21,7.С з Нз 4 01 4 й 484 Вычислено,%, С 34,46; Н 4,47; й 10,96;8 16,72. Спектр поглощения в ультрафиолетовой обФрласти имеет максимум при 260 ммк, Е, см - 179. При повторении опыта идентичным образом, но с использованием 3,3 г 15%.ного раствора л толуолсульфокислоты в ьктаноле, на последующей стадии осаждения с применением 25 мл диэтилового эфира, получают 1,18 г соли, ВАМ ф Н 2 804 4 ССНз Сб Н 480 з Н, характеристики которой идентичны характеристикам, установленным для продук.60 та из примера 1,Приоритет по пунктам27.06.73 по пп. 1 и 224,05.74 по пп, 3 и 4 Составитель С, ПлужновТехред А. Демьянова Корректор Е. Папп Редактор Л. Новожилова Заказ 295/702 Тираж 553 Подписное ПНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изооретений н открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская нао., д. 4/5филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Про ктная, 4 1. Способ получения двойных солей 8 - адено. зил - 1. - метионина. (8 АМ) - метионина (8 АМ) с серной кислотой и и - толуолсульфокислотой, о т . л и ч а ю щи й с я тем, что готовят концентрированный раствор 8 АМ с помощью лизиса клеток дрожжей обработкой этилацетатом и серной кисло. той или путем энзиматического синтеза действием специфического энзима АТФ- метионинаденозилтрансферазы высокой степени чистоты на смесь аденозилтрифосфата (АТФ) и метионина, 8 АМ, присутствующий в растворе, осаждают подкислением раствором пикролоновой кислоты, полученный пикролонат 8 АМ растворяют в смеси, состоя. щей из равных обьемных частей водного рас 1 вора одинаковых нормальностей и . толуолсульфо. кислоты и серной кислоты и органического растворителя, частично смешивающегося с водой, соль 8 АМ осаждают из водного слоя растворителем, полностью растворимым в воде, таким как кетон или спирт, используя 4-8 об, органического растворителя по отношению к Юм водного раствора, выделенную соль раСтворяют в 10-Ю о.ном растворе п толуолсульфокислоты в метаноле и образо. вавшуюся двойную соль 8 АМ осаждают подходящимм органическим растворителем,102. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что энзиматический синтез 8 АМ иэ АТФ и метионина осуществляют путем пропускания раствора, содержащего два реагента, через колонку активированного полисахаридного геля, с которым связан энзнм высокой степени чистоты. 3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что получение двойной соли 8 АМ обработкой метагнольным раствором и - толуолсульфокислоты проводят с использованием минимального количества м:танола, требующегося для растворения соли и при дальнейшей обработке органическим растворителем осаждают двойную соль 8 АМ ф Н 80 фН, 80 СН,СаН.8 ОэН. 4. Способ поп.1,отличающи йся тем, что получение двойной соли 8 АМ обработкой метанольным раствором и - толуолсульфокислоты проводят с использованием большого избытка мета. иола и при далъюйшей обработке органическим растворителем выделяют двойную соль 8 АМЪ Н 804 Нз 804 ф СНзСаН 480 зН