Способ определения физиологической активности вещества

ОЮЗ СОВЕТСКИХОЦИАЛИСТИЧЕСКИХЕСПУБЛИК по п 1 77869(я)5 6 01 й 33/48, А 01 6 7/О НИЕ ИЗОБРЕ ОП И СВИДЕТЕЛЬСТВУ ВТОРСКО 30,Изобретение отнии, биологии и мож ится к области хибыть использовано ически активных веется точн роще- и споени ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНВЕДОМСТВО СССР(71) Казанский институт биологии(56) Авторское свидетельство ССС3 Ф 972400, кл. 6 01 М 33/48, 1980.Авторское свидетельство ССС1 Ф 1221598, кл. 0 01 й 33/15, 1984Патент Великобритании М 20кл. 6 01 й 33/48, 1983. для скрининга физиолоществ.Целью изобретениние, ускорение и повыщ На чертеже представлена модель, объясняющая принцип измерения водного потенциала листа с помощью камеры давления и демонстрирующая механизм увеличения водн го потенциала при увеличении проницаемости плазмалеммы, В табл.1 показано влияние физиологически активных соединений на величину водного потенциала листьев пшеницы и осмотический потенциал их ксилемного сока, в табл,2 - изменение параметров водного режима листьев хлопчатника при изменении концентрации раствора физиологически активного соединения, в табл,З показано перераспределение катионов между симпластом и апопластом мезофилла при действии физиологически активного вещества на растение хлопчатника.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА(57) Использование: биотехнология, физиология и биохимия растений, растениеводст.ва. Сущность изобретения;физиологическую активность вещества определяют путем воздействия им на растительный материал и измерениябиологических показателей при этом в качестве биологических показателей исследуют водный потенциал листа и осмотический .потенциал ксилемного сока этого же листа,1 илЗ табл. Предлагаемыи способ реализуется следующим образом,Готовится раствор исследуемого вещества заданной интересуемой концентрации,Этим раствором производится опрыскивание надземной части растения. Затем измеряются параметры водного режима (водныйпотенциал листа и осмотический потенциалксилемного экссудата) листа с обработанного исследуемым веществом растения. Этипоказатели сравниваются с аналогичными,измеренными на листе контрольного растения, выращенного в тех же условиях, что иопытный вариант,Измерение водного потенциала листаосуществляют с помощью камеры давления.Осмотический потенциал ксилемного сока,извлеченного из листа камерой давления,определяют микрокриоскопическим осмометром,Согласно используемой методике дляизмерения данных показателей водного режима листа лист отделяется от растения лищьк моменту измерения. Лист помещают в камеру давления черешком наружу, В камередавления давление инертного газа (Р) повы 1778697шается до тех пор, пока оно не уравновесит отрицательное гидростатическое давление, возникшее в ксилеме при срезании листа. В момент появления ксилемного сока на срезе черешка водный потенциал листа ф) равен внешнему давлению газа ф = Р), регистрируемому манометром Превышение внешнего давления на 1 - 2 атм величины водного потенциала листа позволяет извлечь пробу сока из апопласта листа (ксилемы), Оценка осмотического потенциала ф.) этого сока микрокриоскопическим осмометром производится сразу же после определения водного потенциала листа. Определение этих двух параметров ф и Ь) для одного листа производится всего за 4 - 5 мин.Уже по изменению водного раствора потенциала ф листа по отношению к контролю можно судить о физиологической активности исследуемого вещества; чем больше отличается водный потенциал опытного листа от контрольного, тем выше физиологическая активность исследуемого вещества, Однако такая оценка, обнаруживая эффект, не вскрывает механизм действия исследуемого вещества. Изменение водного потенциала листа в такой ситуации может быть расценено и кэк следствие изменения эластичности клеточных стенок, Дополнительное измерение осмотического потенциала ксилемного сока, обнаруживающее его изменение по сравнению с контролем, свидетельствует об изменении проницаемости мембран клетки и, в частности, плазмалеммы клеток мезофилла при действии физиологически активного вещества.Моделирование метода определения водного потенциала листа наглядно демонстрирует причину изменения параметров водного режима листьев. Лист можно схематически представить в виде двух сосудов, разделенных полупроницаемой мембраной 1 чертеж. Один сосуд соответствует клеткам мезофилла листа с водным потенциалом ф, а другой - ксилеме с осмотическим потенциалом фЪ. До отрыва листа равновесие, существовавшее между клетками мезофилла и ксилемой, создавалось равенством водного потенциала листа и силой натяжения раствора в проводящей системе ксилемы. В момент отрыва листа при перерезании черешка начинает работать закон осмоса и вода ксилемы начинает проникать в клетки мезофилла. Вода из правого сосуда перемещается в левый. В результате уровень жидкости в правом сосуде начинает снижаться, .а в левом - повышаться, Это будет продол 35 40 . сока у листьев опытных растений 45 50 55 5 10 15 20 25 30 жаться до тех пор, пока дополнительное давление на жидкость в левом сосуде, образующееся за счет разницы уровней жидкости (Ь), не скомпенсирует осмотическое давление растворенного вещества (давление столба и подобно тургорному давлению лимитирует процесс передвижения жидкости из правого сосуда в левый). Если после установления равновесия оказать давление нэ поверхность жидкости в левом сосуде сжатым нейтральным газом в такой степени, чтобы вернуть уровни жидкостей в обоих сосудах в исходное состояние (О), то величина этого давления будет соответствовать величине водного потенциала листа ф и может быть измерена манометром (М) (чертеж).Поскольку у большинства ассимилируюших видов растений=О, давление, регистрируемое манометром при появлении нэ срезе черешка листа ксилемной жидкости, приравнивается водному потенциалу ф. Однако, если полупроницаемая мембрана потеряет свойственную ей селективность и будет пропускать осмотически активные вещества в апопласт листа, то осмотический потенциал ксилемного сока ф будет сильно отличаться от нуля и при измерении водных потенциалов листьев будет наблюдаться завышение показателей Следовательно, завышение показателей водного потенциала листэ.у обработанных физиологически активными соединениями растений по отношению к контрольному варианту свидетельствует об изменении проницаемости плазмалеммы клеток мезофилла, т.е. об изменении электрохимического градиента на ней, что подтверждается изменением осмотичности ксилемного В основе способа лежит определение физиологической активности вещества по реакции на последнее живого растительного объекта, что позволяет повысить точность способа определения физиологической активности исследуемого вещества.Проведена серия экспериментов по исследованию физиологической активности ряда классов химических соединений (инсектицидов. поверхностных разобщителей, модификаторов мембран, синтезируемых и испытуемых химическим НИИ по закрытой тематике), которая показала, что механизм действия исследованных физиологически активных соединений заключается в их воэдействии на проницаемость плазмалеммы,что, в свою очередь, проявляется в изменении водообмена листьев, обработанных исследуемым веществом. В табл.11778697 Таблица 1 блица Т ца представлены данные для характерных известных соединений исследуемых классов физиологически активных веществ, описывающие реакцию листьев пшеницы на соответствующее воздействие, Во всех 5 исследуемых случаях наблюдается корреляция в поведении водного потенциала листьев и осмотического потенциала их ксилемного экссудата: увеличение /Л ком, пенсируется уменьшением Ь таким обра зом, что в сумме абсолютные значения этих параметров равны абсолютной величине водного потенциала листа контрольного растения,т.е.фЛ= ф. + фз,чтосогласуется с предлагаемой моделью (чертеж), 15Изменяя концентрацию раствора исследуемого вещества, можно менять интенсивность воздействия на живой объект .(табл,2) и тем самым установить концентрационные пределы его физиологической ак тивности по обратимости воздействия на растение вплоть до летальной дозы, Исследуя кинетику описанных выше показателей водного режима по временной шкале длительности воздействия исследуемого веще ствэ можно судить о глубине и сложности перестроек в плэзмалемме клеток мезофиллз и возможности восстановительных процессов после действия физиологических активных соединений.Табл.З приведена в качестве примера перераспределения катионов между симпластом и апопластом листа при действии физиологически активного вещества. Формула изобретения Способ определения физиологической активности вещества, включающий обработку исследуемым веществом растительного материала, исследование мембранного потенциала растительных тканей после обработки и оценку физиологической активности путем сравнения с мембранным потенциалом контроля, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения. ускорения и повышения точности способа, исследуемым веществом обрабатывают листья, при исследовании мембранного потенциала измеряют водный потенциал листа и осмотический потенциал ксилемного сока этого же листа и чем выше данные показатели. тем выше активность.. Заказ 4191 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5