Способ определения лектиновой активности

СОКЭЗ СОВЕ ТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 1778698(54) СПОСОБ ОПРЕ ВОЙ АКТИВНОСТИ (57) Использование: биотехнология, имм изобретения; для оп активности готовят разведений исследуе ляют к нему клет СЫагпубогпопаз ге)пЬ реакцию агглютинац реакционной смеси 7 ЛЕНИЯ ЛЕКТИНО ний,физиология расте унология, Сущн еделения лектин яд последовател мого образца, до и микроводороСВ/15 и пров течение 1 ч пр стений и вой ных бавсли одят онина, Е,С,К иска лектинической сперекомендац агд ив 0 - 7 гается новым овой активно- ности отдель- последующей ем в качестве т микроводоЖ 1 СЯ мета оатных раконцентра ии клеток, агдам звеции 1,5 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) И нсти тут физ иоло гК.А,Тимирязева(56) Луцик и др. Методы иопределения их иммунохфичности. МетодическиЛьвов, 1980,Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к исследованию биологических материалов, а именно к способам определения лектиновой активности и может найти применение при анализе биологических объектов и определения структуры и качественного состава лектинов.Известен способ определения лектиновой активносги при гемагглютинации, Принцип его заключается в том, что к серии последовательных разведений добавляют 2%-ную суспензию эритроцитов и после инкубации определяют агглютинацию эритроцитов визуально, Титр лектина выражают наибольшим разведением раствора, дающего агглютинацию.Недостатками этого способа являются использование эоитроцитов для тестирования гемагглютинирующей активности. Во.первых, не всегда имеется возможность взятия крови у животных из-за их отсутствия или болезни. Необходимы большие средства для поддержания вивария. Во-вторых, эритроциты могут храниться в хорошем состоянии очень ограниченное время (сутки или несколько суток), по истечении которого необходимо повторное взятие крови. Кроме того, с помощью традиционного способа тестирования лектинов по агглютинации эритроцитов не могут быть выявлены лектины из всех обьектов, Предложен способ определения лектиновой активности с помощью клеток микроводоросли СЫагпубогпопаз гепЬагбб СИ/-15, с помощью которого могут. быть выявлены лектины, имеющие углеводсвязывающие участки, характерные для растительных объектов и не взаимодействующие с эритроцитами или другими ранее предложенными объектами.Целью изобретения является расширение сферы возможностей способа и уменьшение трудоемкости процесса,Поставленная цель дости способом определения лектин сти с использованием способ ных клеток к агглютинации и визуальной оценкой ее, прич отдельных клеток использую росль СЫагпубогпопаз геи аг глютинацию проводят последовательных четырехк дений лектина в известной при рН 7.0-7,4 и концентрац 2 5;45 10 15 20 25 30 35 40 45 50 При проведении реакции агглютинации при рН больше или меньше названных пределов клетки водорослей лизируют, При концентрации клеток ниже 1,57 ь осадка не образуется, при концентрации выше 2,5 во всех лунках выпадает осадок,П р и м е р 1, Для проведения реакции гемагглютинации берут нужный объем раствора крови в Консерванте, трижды отмывают физиологическим раствором на холоде при центрифугировании 1,5 тыс об/мин 10 мин и ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,2 до концентрации эритроцитов 2. Эту суспенэию используют для определения лектиновой активности на пластиковых планшетах с О-образными лунками с объемом 200 мкл. Калиброванный пипеткой в каждую лунку вносят. по 150 мкл буфера, в пеовчю лунку добавляют 50 мкл раствора коммерческого лектина конканавалина А(соп д в фосфатном буфере 1 мгУмл и делают последовательное четырехкратное разведение этого лектина, Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии эритроцитов и перемешивают содержимое лунок путем осторожного встряхивания планшета в горизонтальной плоскоСти. Оставляют на 2 ч при комнатной температуре, Результаты реакции учитывают невооруженным глазом. Определяют последнее разведение белка, при котором еще происходит гемагглютинация, В тех лунках, где белок вызывает агглютинацию, эритроциты покрывают дно ровным слоем, При отсутствии агглютинации они скапливаются в центре углубления лунки, образуя компактную пуговку с резко очерченными краями. Конканавалин А вызывает агглютинацию эритроцитов в первых шести :унках, следовательно активность этого препарата составляет 0,244 мкг/мл,П р и м е р 2, Для проведения реакции альгоагглютинации берут нужный обьем суспензии микроводоросли СЫаглубощопаз ге пЬагбб СЧЧ, культивирование которой проводят в накопительном режиме в стерильных условиях при постоянном освещении 60 Вт/м 2, температуре 26 - 28 С и непрерывном барботировании газовоздушной смесью, содержащей 1,7-2% СО в различного типа культуральных сосудах, Среда для культивирования содержит, г/л; МН 4 С 5, М 9504 е 7 Н 20 2, СаС 2 2 Н 20 1, К 2 НРО 4 144, КН 2 РО 4 7,2, раствор микроэлемейтов для сине-зеленых водорослей 1 мл. Отмывают физиологическим раствором на холоде при центрифугировании 2000 об/мин 10 мин и ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,2 до концентрации клеток 2%, Эту суспензию используют для определения лектиновой активности на пластиковых планшетах с О. образными лунками с объемом 200 мкл. Калиброванной пипеткой в каждую лунку вносят по 150 мкл буфера, в первую лунку добавляют 50 мкл раствора соп А в фосфатном буфере 1 мг/мл и делают последовательное четырехкратное разведение белка. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл суспензии водорослей и перемешивают содержимое лунок путем осторожного встряхивания планшета в горизонтальной плоскости, Оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Результаты реакции учитывают невооруженным глазом. Определяют последнее разведение белка, при котором еще произошла альгоагглютинация, В тех лунках, где белок вызывает агглютинацию, клетки водорослей покрывают дно ровным слоем, При отсутствии агглютинации они скапливаются в центре углубления лунки. Соп А вызывает агглютинацию клеток хламидомонады в первых пяти лунках, следовательно активность этого лектина составляет 0,98 мкг/мл.П р и м е р 3. Для проведения реакции альгоагглютинации берут нужный объем суспенэии микроводоросли хламидомонады, отмывают физиологическим раствором при центрифугировании 2000 об/мин 10 мин на холоде и ресуспендируют в фосфатном буфере рН.7,0 до концентрации клеток водорослей 1,50. Далее реакцию альгоагглютинации проводят аналогично примеру 2. Активность Соп А по агглютинации. клеток хламидоманады составляет 0,98 мкг/мл.П р и м е р 4. Реакцию альгоагглютинации проводят аналогично примеру 2. После центрифугирования клетки хламидомонады ресуспендируют в фосфатном буфере рН 7,4 до концентрации 2,5 . Активность Соп А по агглютинации клеток хламидомонады составляет 0,98 мкг/мл.Результаты примеров 2 - 4 показывают, что предлагаемый способ дает воэможность определить лектиновую активность при помощи клеток хламидомонады, уменьшить его трудоемкость в связи с заменой животных клеток на клетки микроводорослей. Фо рмула изобретенияСпособ определения лектиноаой активности, включающий приготовление серии последовательных разведений исследуемого образца, содержащего лектины, добавление к исследуемому образцу суспенэии клеток тест-объекта, инкубацию смеси и визуальную оценку реакции агглютинации, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения процесса, в качестве тест-объекта испольэу1778698 Составитель И. МегераТехред М.Моргентал Корректор И, Шулла,Редактор Заказ 4191 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 10,ют клетки микроводоросли СЫавуболюпаз инкубацию проводят в течение 1 ч при рНге пЬагсП СЧЧ 15 в концентрации 0,3- 0,5, реакционной смеси 7,0-7,4.