Способ определения инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом i типа

(51)5 6 01 ЗОБРЕТЕЕЛЬСТВУ ОПИ ИД ВТОРС КОМ сывороткои крови больного, разведенной питательной средой в интервале соотношений 1:10 до 1:20, при температуре+37 С в течение 30 мин, добавляют к ним эритроциты барана, сенсибилиэированные инсулином, и по усилению их взаимодейстеия при увеличении числа инсулиновых розеток в три и более раэ определяют в крови наличие антител к инсулинорецепторам и диагностируют у больного сахарным диабетом мнсулинореэистентность иммунного генеза. Предлагаемый способ дает также воэможность раннего выявления антирецепторных антител в крови больных диабетом. что позволяет диагностировать начало развития инсулинорезистентности,венный медици В,Быковалогия, М ваи окри ИЯ ИНС ЛЬНЫХ ИНО ХАР ся к клинической ния - повышение сулинорезистентя способа лимфоин кубируют с 8 две центрифужные пробирки (одна - для определения исходного содержания инсулиновых розеток в суспенэии лейкоцитов крови донора, другая - для изучения дейст. вия на клетки сыворотки крови обследуемого) забирают по 0,1 - 0:2 мл крови в 0,1-0,2 мл 5 свежеприготовленного раствора цитрата натрия для предупреждения свертывания крови. После тщательнОго встряхивания содержимого пробирок в него вносят для лизирования эритроцитов по 0,8 - 0;9 мл дистиллированной воды, Смесь встряхивают 20-30 секунд и добавляют до 10 мл среду 199, Суспензии клеток центрифугируют 5-6 минут при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, вновь добавляют 1 мл среды 199 и снова центрифугируют. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной пробирки оставляют временно беэ воздействий. Осадок ат 6 относится к области клины, а именно к лабораторинсулинорезистентности ум диабетомтипа. Изобретенинической медицной диагностикебольных сахарн ры,в и уча реце л об разви етств явлепри цинс Согласно данным литерату и незе инсулинорезистентност с аутоантитела к специфическим п Ранее выявление этих антите е своевременную профилактику т эистентности к гормону и соотв у ее терапию. Однако. методов вь н тител и инсулинорецепторэм г для клиники, в доступной меди к тературе не обнаружено,Целью изобретения является повышение точности диагностики инсулинореэистентности.Способ осуществляют следующим образом. атогетвуют торам. спечит ия реющую ия анодных ой лиГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Пермский государстский институт(57) Изобретение относимедицине. Цель изобрететочности диагностики инности. Для осуществленициты крови донора 1762241 А 1рой пробирки соединяют с 0,1-0,2 мл исследуемой, полученной путем отстаивания крови, декомплементированной сыворотки крови больного, разведенной средой 199 в интервале отношений от 1:10 до 1:20. Смесь осторожно встряхивают и инкубируют при температуре +37 С в течение 30 минут. После инкубацли с сывороткой лейкоциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифгуирования при 1500 об/мин в течение 5-6 минут, затем надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, После этого осадки в обеих пробирках ресуспендируют в 0,1- 0,2 мл изотонического раствора хлорида натрия рН 7,2; К полученным взвесям лейкоцитов добавляют по ф 0,1 - 0,2 мл 0,5 О взвеси эритроцитарного диагностикума, смесь инкубируют при температуре+37 С в течение 1015 минут, а затем в течение 18 асов в условиях холодильника (+4" С). Через 18 часов в обе пробирки добавляют 1 мл 50% бычьей сыворотки, смесь центрифугируют при 15000 об/мин 5 - 6 минут, надосадочную жидкость сливают, а из осадков делаю мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте 20 - 25 минут и окрашивают по Романовскому-гимза, Просматривают под микроскопом при 900-кратном увеличении 100 лимфоцитов, отмечая средл них число (%) лимфоцитов фиксирввавших на себе три и более эритроцита,При налив ли в сыворотке крови больного антител к инсулинорецепторам отмечается активациялимфоцитов крови донора с увеличс;и":м среди них числа лимфоцигов, спо-обных взаимодействовать с эритроцитами барана, нагруженными инсулином, и ростом числа инсулиновых розеток в 3 и более раз, На основании этих данных ставится диагноз псулинорезистентности иммунного генеза.Для приготовления диагностикума используют эритроциты багана, -, обработанные глютаровым альд,эгидом, Свежие эритроци-ы барана трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия рН 7,2, центрифугируя взвесь в течение 10 минут при 1500 об/мин, Из отмытых эритроцитов готовят 5 взвесь, соединяя 0,5 мл осадка эритроцитов и 9,5 мл эабуференного изотонического раствора хлорида натрия рН 7,2. Смешивают 5 О/ взвесь эритроцитов с 0,25 ь свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1.Выдерживают смесь при температуре+37 С в течение 15 минут, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида зэбуференным изотоническим растворам хлорида натрия и доводят тем же5 10 15 раствором до первоначальнбго объема (5 ь взвесь), Приготовленные таким образом эритроциты хранятся при температуре+4 С в течение 6 месяцев,Для сенсибилизации эритроцитов инсулином глютаризированные эритроциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия рН 6.4 и доводят им же взвесь до первоначального объема. Затем соединяют с раствором инсулина, содержащим 20 Ед/мл, в соотношении 1:1. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 минут. после чего отмывают дважды забуференным раствором натрия рН 72. Слив надосадочную жидкость, объем доводят до первоначального (5% взвесь). В реакции используют 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готовят из исходной5%) взвеси путем соединения 1 мл ее с 9 мл20 среды 199.П р и м е р 1. Больная Л-ва И.Е 18 лет,поступи;а в эндокринологическое отделе-.ние ОКБ г.Перми 5 января 1989 года с жало-бами на общую слабость, жажду, Больная с25 декабря 1988 года после перенесенногопростудного заболевания, Была тяжелая диабетическая кома. Объективно: пониженного питания, весь 50 кг. Тоны сердцаприглушены, АД - 90/60 мм рт.ст., дыхание30 жесткое, Живот мягкий, печень увеличена ивыступает а 1,5 см из-под реберной дуги.Содержание сахара в крови 14,3-23,7 - 28,6м/моль/л, в моче - 4-3;4, ацетон+. Ббльнаяполучает 44 ЕД инсулина. Диагноз: сахар 35 ный диабет, 1 тип, тяжелая Форма, лабиль. ное течение, декомпенсированньй.Диабетическая энц-Фалопатия, Хрониче.ский пиелонефрит, 11 нсулинорезистентность,40 При изученли сыворотки крови больнойв две центрифужные пробирки забирали по0,1 мл крови в 0,1 мл 5 свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого пробирок в него45 вносили по 0,8 мл дистиллированной воды. азатем до 10 мл среду 199. Суспензии клетокцентрифугировали 5 мин при 1500 об/мин,после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 мл среды и сно"0 ва центрифугировали при том же режиме.:и сосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной,сывороткой крови больного, разведенной55 средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожновстряхивали и инкубировали при температуре +37 С в течение 30 минут, После инкубации лейкоциты отмывали изооническимраствором натрия хлорида путем центрифугирования и отсасывали налосадочную жид 1762241510 15 20 25 30 35 40 45 50 кость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2, К полученным взвесям лейкоцитов добавляли по 0,1 мл 0,5 О/ взвеси эритроцитарного диагностикума, и смесь инкубировали при температуре +37 С 10 минут, затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4 С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50 О бычьей сыворотки, и смесь центрифугировали при 15 об/мин в течение 5 минут, Надосадочную жидкость сливали а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 минут и окрашивали по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов. отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.В сыворотке крови больной обнаружены антитела к инсулинорецепторам, так как сыворотка антивировала лимфоциты крови донора, увеличивая число инсулиновых розеток в 4,5 раза (разведение 1:10) и в 7,5 раза (разведение 1:20). На основе этих данных поставлен диагноз инсулинорезистентности имунного генеза,П р и м е р 2. Больной М-в Г.В., 32 года, поступил в эндокринологическое отделение ОКБ г. Перми 2 ноября 1988 года с жалобами на боли в эпигастральной области, тошноту, рвоту, похудание, Болен с 1984 года, Обострение заболевания началось с 9 октября 1988 года. Объективно: больной истощен (- 15 кг), Сердце и легкие без особенностей. Язык обложен. Живот резко болезненен в зоне проекции поджелудочной железы. Печень резко выступает из"под ребреного края на 5 см, Содержание сахара в крови 15,2 - 12,9 - 9,0 - 14,4 - 28,4 м/моль/л, в моче - .б - 7; Больной получает 208 ЕД инсулина, Диагноз: хронический панкреатит, болевой вариант, рецидивирующее гечение, обострение. Панкреатический сахарный диабет, декомпенсация. Инсулинорезистентность.При изучении сыворотки крови больного в две центрифузные пробирки забирали по 0,1 мл крови в 0,1 мл 5 свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого прсбирок в него вносили оо 0,8 мл дистиллированной воды, затем до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 мл среды и снова центрифугировали при гом же режиме. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови больного, разведенной средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали и ри температу. ре+37"С в течение 30 мин. После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования и отсасывали надосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2. К полученным взвесям.лейкоцитов добавляли по 0.1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, и смесь инкубировали при температуре ф 37 С 10 минут, а затем в течение 18 часов в условиях холодильника +4 С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50 О бычьей сыворотки, и смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 мин и окрашивали по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов, отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.Заключение. При исследовании сыворотки крови больного заявляемым способом обнаружены антигела к инсулинорецепторам, так как сыворотка активировала лимфоциты донора и увеличивала число инсулиновых розеток в 3,7 раза разведение 1;10) в 5 раз(разведение 1:20). На основе этих данных поставлен диагноз инсулинорезистентности иммунного генеза,П р и м е р 3. П-в И.И 30 лет, практически здоровый донор. Обьективно: нормальное телосложение, вес 64 кг. Язык чистый, Сердечно-сосудистая и дыхательная системы без особенностей, Живот мягкий, безболезненный. Содержание сахара в крови в норме, При исследовании сыворотки крови донора в две центрифужные пробирки забирали по 0,1 мл крови в 0,1 мл 5/ свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого пробирок в него вносили по 0,8 мл дистиллированной воды, а затем до 10 мл среду 199, Суспенэии клеток центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой. добавляли 1 л среды и снова центрифуги ровали при том же режиме. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови донора. разведенной средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре +37 С в течение 30 минут, После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифу1762241 Составитель А.БыковаТехред М,Моргентал Корректор С.Юско Редактор Заказ 3257 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 гирования и отсасывали надосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2. К полученным взвесям лейкоцитов добавляли. по 0,1 мл 5 взвеси зритроцитарного диагностикума, и смесь инкубировали при температуре+37 С 10 минут, затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4 С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50 бычьей сыворотки,.и смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, Надосадочную жидкость сливали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 минут и окрашивали по Романовскому-Гимза. ф Просматривали под микроскопом 100 лимФоцитов. отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.В результате исследования установлено. что обработка лимфоцитов донора разведенной сывороткой крови здорового человека число инсулиновых розеток практически не изменяла (исходное число 9, после обработки сывороткой, разведенной 1:10 - 7 О, разведенной 1:20 - 4), Заключение: антител к инсулинорецепторам в крови донора нет.Преимущества способа заключаются вего высокой специфичности и чувствительности, технической простоте исполнения и чтения его результатов. малом (0,1-0,2 мл) количестве крови, забираемой у больного из пальца. в необходимости минимальных количество доступных реактивов и несложного оборудования, что позволяет осуществлять проведение способа в условиях клиники (больницы), в отсутствии необходимости привлечения высококвалифицированного 5 персонала для реализации способа. Выяснение генеза неэффективности инсулинотерапии, обусловленной разными иммунными факторами (антитела к инсулину, инсулинорецепторам и т,д,) представляет большой 10 практический интерес, являясь основой длярациональной гормонотерапии, иммуносупрессивного и других видов лечения.Способ дает также возможность раннего выявления антирецепторных антител в 15 крови больного диабетом, что позволяет диагностировать начало развития инсулинорезистентности. Ф ор мул а и зоб ретен и я 20 Способ определения инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом типа, включающий забор крови и ее иссле-.дование, о т,л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью пс вы щения точности способа, иэ кро ви выделяют сыворотку, разводят ее средой199 в соотношении 1;10-20, инкубируют с лимфоцитами здорового человека при 37 ОС в течение 30 мин, добавляют эритроциты барана. сенсибилизированные инсулином, 30 подсчитывают количество роэеткообраэующих клеток и при увеличении их количества в 3 и более раэ по сравнению с контролем определяют инсулинорезистентность имунного генеза.35