Способ выявления снlамydiа тrасноматiy

ВЕТСКИХ ТИЧЕСКИ СОЮЗ С СОЦИАЛ ЕСПУБ 0104(51) 5 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯАВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ательский логии им,х, М. В НДелекний, перес, 272-274.АМУОАдицинеаГностик(56) Овчинников Н. М., Беднова В,торский В, В. Диагностика заболевадающихся половым путем, М., 1987,(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СНТВАСНОМАТ 3(57) Изобретение относится к меможет быть использовано для ди Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики урогенитальных хламидиозов.Наиболее достоверным методом диагностического подтверждения хламидиозов у больных является выделение хламидий в культуре чувствительных клеток,Однако, почти все возбудители вида С. тгасЬогпатз практически не обладают способностью инфицировать клетки и чТго и размножаться в них в обычных условиях.В связи с этим для диагностического выделения хламидий используют перевиваемые линии клеток фибробластов мыши 1 - 929, Мс Соу, а также клетки человека Неа, которые обрабатывают различными методическими приемами, повышающими чувствительность клеток и усиливающими процессы адсорбции, проникновения и развития хламидий в них. урогенитальных хламидиозов. Целью изобретения является упрощение способа, повышение эффективности и сокращение сроков изоляции хламидий. Поставленная цель достигается предварительным накоплением возбудителя непосредственно в эпителиальных клетках соскобного материала урогенитального тракта, использованием чувствительной клеточной культуры первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, заражением во взвесь указанной культуры без предварительной обработки, Предлагаемый способ позволяет сократить сроки исследования больных и повысить эффективность диагностики. 1 табл. С этой целью применяют обработку монослоя клеток ДЭАЭ-декстраном, антиметаболитами (циклогексимидом, 5-йоддезоксиуриди нам (ИДУ), облучение. моно- слоя клеток у или Х лучами, центрифугирование инокулята на монослой, а также сочетание физико-химических воздействий.Используют чувствительную культуру клеток, адаптированную к среде 199 с 10 сыворотки КРС и выращенную во флаконах или пробирках в течение 24-48 ч.При обработке.ДЭАЭ-декстраном перед заражением клеток среду роста удаляют и вносят 1 мл рабочего раствора ДЭАЭ-декстрана (90 мгк/мл) на 30 мин. Перед заражением монослоя среду, содержащую ДЭАЭ-декстран, удаляют, Обработанную культуру клеток инфицируют исследуемым материалом по 0,2 мл, Затем пробирки с материалом центрифугируют в горизонтальном роторе (2900 9 1 ч при 30 - 34 С. Послецентрифугирования инокулят удаляют, вно- занными выше методами через 24 ч после сят 1 мл среды следующего состава: среда заражения, а при отрицательных результа 199 с 5 ф, фетальной сыворотки КРС и,0,5 мл тах - через 48 ч, Срок диагностического вы-ного раствора глюкозы, а также антиби- деления хламидий из исследуемого отики - стрептомицина 200 мкг/мл, нистати материала от больных составляет 2 - 3 дня, а на 125 мкг/мл, канамицина 100 мкг/мл и процент положительных находок - 63 ,. инкубируют 48 - 72 ч при 36 С. Этот показатель практически не уступаетВ случае использования антиметаболи- таковым, полученным при использовании тов циклогексимид добавляют в среду после трудоемких методов с применением дорого- заражения клеток в концентрации 1 - 2 10 стоящих дефицитных реагентов.мкг/мл, ИДУ обрабатывают суточный моно- Поставленная цель достигается тем, что слой клеток эа 3 дня до инокуляции, Оценку для накопления возбудителя в эпителиальпервичного заражения клеток проводят че- ных клетках соскобного материала больныхо рез 3 сут в препаратах монослоя, окрашен- пробы инкубируют в термостате при 36 С в ного по Романовскому-Гимзе (по 15 течение 24 ч, Затем инокулят вносят непособнаружению морфологических структур редственно во взвесь чувствительной перхламидий)и иммунолюминесцентным мета- вично-трипсинизированной культуры дом(по обнаружению хламидийного антиге- клеток фибробластов эмбриона мыши без на), дополнительной обработки.При использовании указанных методов 20 П р и м е р 1. Исследуемый материал, процент диагностического выделения хла- взятый ложкой Фолькмана со слизистой момидий составляет от 20 до 70, а процесс чеполовык органов больного, помещают во изоляции хламидий продолжается 3 - 5 дней, . флакон с 2 мл охлажденной транспортной так как для заражения используют 1-2-су- среды с антибиотиками(среда 199 с 5% сыточную культуру чувствительных клеток, 25 воротки КРС или сахарозо-фосфатный расНедостатками этого метода являются твор рН - 7,0 - 7,1 с 5/, той же сыворотки и трудоемкость исследования; необходи- гентамицина 2 мкг/мл). После 3-часовойомость использования дорогостоящих дефи- экспозиции в холодильнике при+4 С флакоО цитных реагентов и фетальной сыворотки ны помещают в термостат на 24 ч при 36 С, КРС; продолжительный срок исследования 30 Затем исследуемый материал центрифуги(от 3 до 5 дней), руютпри 2500 9 10 мин и центрифугат исИзвестен также метод выделения С. пользуют для заражения во .взвесь тгаспотатэ в чувствительной перевиваемой чувствительных первично-три пси низи роклеточной культуре эпителия эмбриона мы- ванных клеток фибробластов эмбриона мыши (ММС - Е) при заражении монослоя без 35 шиспоследующейинкубацией втермостатеодополнительной обработки клеток, поэво- при 36 С втечение 24 - 48 ч.ляющий сократить сроки изоляции возбуди- Получение первично-трипсинизировантеля до 1 - 2 дней. ных клеток фибробластов эмбриона мыши.Недостатки этого метода: отсутствие Белых мышей в последние дни беременуказанной культуры клеток в СССР, необхо ности вскрывают под наркозом, извлекают димость использования дефицитной фе- эмбрионы, освобождают от внутренних ортальной сыворотки КРС, ганов, обезглавливают, отмывают 2-3 разаЦель изобретения - упрощение спосо- раствором Хенкса с антибиотиками, измельба,. повышение эффективности и сокраще- чают ножницами и трипсинизируют, Трипние срока изоляции хламидий. 45 син удаляют и клетки вносят в средуПоставленная цель достигается за счет следующего состава (среда 199+5 десяти- предварительного накопления возбудителя кратного концентрата этой же среды +10 непосредственно в эпителиальных клетках бычьей сыворотки +гентамицин 2 мгк/мл), соскоба урогенитального тракта, по отно- Полученную взвесь клеток эмбриона мыши шению к которым С. сгасЬогпабэ обладает 50 раэливаютвпенициллиновыефлаконыспо 5выраженным тропиэмом и в них происходит кровными стеклами по 1,5-2 х 10 клеток в 1 размножение возбудителя после заражения мл и сразу же во взвесь клеток вносят цент- человека;использованиячувствительной кле- рифугат соскобного материала после пред- точнойкультуры первично-трипсинизирован- варительного накопления возбудителя по ных клеток фибробластов эмбриона мыши; 55 0,1 мл в каждый из 4 флаконов, используе- заражения указанной культуры клеток не на мых для исследования одного заражающего монослой, а во взвесь клеток без их предва- материала (пробы). Флаконы с инокулятом рительной обработки, без дополнительной обработки помещают вОбнаружение морфологических струк- термастат при 36 С на 24 ч, По истечении тур хламидий и их антигена проводят ука- указанного срока покровные стекла с зараженным монослоем клеток из двух флаконов извлекают, промывают фосфатно-солевым буферным раствором, подсушивают на воздухе и фиксируют одно из них 10 мин в 96 этаноле. а другое - 15 - 20 мин в охлажденном ацетоне для окрашивания по Романовскому-Гимзе и иммунолюминесцентным методом соответственно. Оценку резул ьтатов заражения клеток проводят по выявлению морфологических структур хламидий (при окраске по Романовскому-Гимзе) и их антигена (в реакции иммунолюминесценции).П р и м е р 2. Больной К., 43 лет, история болезни М. 146. Диагноз: хронический уретропростатит хламидийной этиологии.Для исследования забирают соскобный материал-эпителий слизистой уретры, помещают во флакон с 2 мл транспортной среды и оставляют при +4 С на 3 ч. Затем исследуемый материал делят на 2 части. Одну часть в объеме 1 мл вносят во флакон с ростовой средой и помещают в термостат на 24 ч при т 36 С для предварительного накопления возбудителя в эпителиальных клетках взятого соскоба (исследуемого материала),По истечении указанного срока исследуемый материал центрифугируют при 25009 10 мин и центрифугат по 0,1 мл вносят в пенициллиновые флаконы с покровными стеклами, содержащие взвесь первичнотрипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши, приготовленную ех 1 еароге.Флаконы с инокулятом инкубируют в термостате при 36 С в течение 24-48 ч, после чего покровные стекла с инфицированным монослоем клеток извлекают, промывают фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР), подсушивают на воздухе, фиксируют 10 мин в 96 спирте для окраски по Романовскому- Гимзе и 15 мин в холодном ацетоне для окраски люминесцирующими антителами. Другую часть исследуемого материала (без предварительного накопления возбудителя) в объеме 1 мл вносят по 0,2 мл во флаконы с выращенным на покровных стеклах монослоем двухсуточной культуры перевиваемых клеток 1-929,Флаконы с материалом центрифугируют нагоризонтальном роторе в течение 1 ч при5 2400 9 для принудительной адсорбции возбудителя на клетках. После этого во флаконы вносят поддерживающую среду иинкубируют в течение 24 - 48 ч. Через 24-48ч после заражения покровные стекла извле 10 кают, фиксируют и окрашивают аналогичным споаобом.В таблице приведены сравнительныепоказатели выделения С. сгасйогпабз призаражении на монослой перевиваемой куль 15 туры клеток 1-929 и во взвесь первичнотрипсинизированных клеток фибробластовэмбриона мыши,Как видно из данных таблицы, процентвыделения С 1 гаспогпабв при заражении во20 взвесь первично-трипсинизированных клеток фибробластов эмбриона мыши послепредварительного накопления возбудителяв исследуемом материале был достоверно(Р 0,05) выше по сравнению с методом зара 25 жения на монослой перевиваемых клеток1 - 929 с применением дополнительного центрифугирования,Таким образом, использование исследуемого материала от больных после пред 30 варительного накопления для заражения вовзвесь первично-трипсиниэированных клеток эмбриона мыши позволяет упроститьметод выделения хламидий, повысить эффективность выделения возбудителя и со 35 кратить срок исследования.Формула изобретенияСпособ выявления Стащу(3 асгасЬоааОз путем соскоба эпителия урогениталий с последующим заражением пол 40 ученным материалом клеточной культуры,инкубированием, приготовлением препаратов и их исследованием. о т л и ч.а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения эффективности иускорения способа, полученный материал45 предварительно выдерживают при 36 С втечение 24 ч, а для заражения используютпервично трипсинизированные клетки фибробластов эмбриона мыши,1723129 Методы выделения возбудителя Количество наблюдений Количество наблюдений сполошительным результатом абс. Ф 19 . 39,5 35 63,0 2-3 Р (005 Составитель И.ЛебедюкТехред М.Моргентал Корректор С.Черни Редактор А,Долинич Заказ 1043 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Зарашение на монослой перевиваемой культурыклеток 1-929 исследуемым материалом отбольных с применением дополнительногоцентрифугирования.Зарааение во взвесь первично-трипсинизированной культуры клеток фибробластов эмбриона мыши исследуемым материалом после предварительного накопления воз- будителя Р/по критерию