Способ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕ гСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 266)5 6 01 й 33/68 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯ БРЕТЕЬФ у ПИСА 36ательский институт фиины и Научно-про- обьединение Добрецо ва и И.Г.Е Б,М,Красмоленко ортная функция сыво 1975, с. 183,способам иссжидкостей, а и крови, и моучения других умин. О р,(56) Чегер С,И. Транспроточного альбумина Изобретение относится едования биологических менно альбумина сыворот жет быть использовано для и жидкостей, содержащих аль Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выявления снижения связывающей емкости альбумина, включающему добавление к разбавленной сыворотке крови веществ, специфически взаимодействующих с альбумином, последующее фото- метрическое измерение параметра раствора и определение его отклонения от нормы, в качестве вещества, специфически взаимодействующего с альбумином, используют флуоресцирующие соединения (ФС) - М-карбоксифенилимиды 4-замещенной 1,8-нафталиндикарбоновой кислоты формулы(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ ЕМКОСТИ АЛЬБУМИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - упрощение и ускорение способа, Сущность его заключается в том, что флуоресцентным способом измеряется связывание с альбумином флуоресцирующих И-карбоксифенилимидов 4-замещенной 1,8-нафталиндикарбоновой кислоты. Для проведения анализа достаточно 0,01 мл сыворотки крови. Расход красителя 11 мг на 1000 анализов, Длительность определения не более 3,5 мин. 3 табл,00где Я .= и(Снз)2, й(С 2 н 5)2:Й 1 = Н, СООН;Й 2 = ОН, СООН.Часть указанных соединений известна,Соединение, где В - М(С 2 Н;)2, В 1= Н, Р 2= фГЪ= СООН, получают следующим образом,К кипящему раствору 6,62 г (0,02 моль)М-карбоксифенилимида 4-хлорнафталино- ) авой кислоты в 100 мл диметилформамидапри размешивании в течение 30 мин по кацлям добавляют 10 мл диэтилами а. Нагревреакционной массы продолжаюг 7 ч, послечего ее выливают в воду. Выпавший осадокфильтруют, промывают водой. Выход 4,7 гНайдено, М 6,9; С 70,8; Н 5,0,С 23 Н 20 Й 204Вычислено,: й 7,2, С 71,1, Н 5,2.Все перечисленные ФС используютсякак люминесцентные красители при получении дневных флуоресцентных пигментов впроизводстве пластических масс, Для целейисследования биологических жидкостей ихиспользование неизвестно,Согласно предлагаемому способу указанные ФС используются для измерениясвязывающей емкости альбумина,Установлено, что эти вещества в воднойсреде не флуоресцируют, а при связыванииих с альбумином появляется интенсивноесвечение, При соблюдении определенныхусловий по интенсивности флуоресценцииможно судить о количестве связанных с альбумином молекул ФС, Вещество добавляется в раствор в избыточном по отношению кальбумину количестве. При снижении связывающей емкости альбумина уменьшаетсяколичество связанных с альбумином молекул ФС, что выражается в снижении интенсивности флуоресценции.Для осуществления способа сывороткукрови разводят в 100 - 2000 раэ буфернымраствором с рН 7,4 + 0,2, добавляют раствор ФС (в любом растворителе, в которомФС имеет предел растворимости не менее1 мМ) в концентрации 2400/Х - 3600/Х мкМ,где Х - разведение сыворотки крови, и измеряют интенсивность флуоресценции полученного раствора в области максимальногосвечения.Аналогичным образом обрабатываютстандартный раствор альбумина. Результатизмерения выражают как процентное отношение интенсивности флуоресценции ФС висследуемом образце к интенсивности флуоресценции ФС в стандартном альбумине.Это отношение и есть связывающая емкость альбумина (СЕА). Выявляют снижениеСЕА у пациента, если данный показательменьше нижней границы нормы. За нижнюю границу нормы принято значение СЕА,равное 85 ф,Интервал разведения сыворотки кровиограничен тем, что при массивной гипербилирубинемии билирубин поглощает 10 - 12 0 флуоресцентного света ФС при разведениисыворотки в 100 раз. Поэтому меньшее разведение сыворотки будет давать большуюпогрешность. Разведение сыворотки болеечем в 2000 раз требует 2 - 3-ступенчатой процедуры, что усложняет способ. Интервал рНбуферного раствора соответствует интервалу рН крови больных.Предельное количество молекул, которое может связать альбумин, т,е. его свяэы 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 вающая емкостьопределяется при избыточном добавлении ФС. Избыточной концентрацией ФС для любой сыворотки кровиявляется концентрация больше 2400/ХмкМ, где Х - разведение сыворотки, Но приувеличении ФС более 3600/Х мкМ становятся существенными явления экранировкисвета, Поэтому интервал концентраций ФС,применяемый в предлагаемом способе, -2400/Х - 3600/Х мкМ.Изобретение иллюстрируется примерами.П р и м е р 1. Чтобы показать, что ФСспецифичен к альбумину в сыворотке крови,разделяют 8 образцов сыворотки крови наальбумины и глобулины при помощи полиэтиленгликоля. Фракцию альбуминов разводят в буферном растворе(10 мМ трис,НС,рН 7,2) в Х = 100 раэ, добавляют 1 мМ раствор ФС (В = й(СНз)2, В 1 = СООН, В 2 = ОН) вдиметилсульфоксиде до конечной концентрации 3600/Х = 36 мкМ и измеряют интенсивность флуоресценции при длине волны530 нм (возбуждение при 420 нм). Затемдобавляют в этот же раствор глобулины, интенсивность флуоресценции практическине изменяется. Если же вместо глобулинов(или вместе с ними) добавить эльбумин, тоинтенсивность флуоресценции возрастаетпропорционально количеству эльбумина.Это говорит о том, что в цельной сывороткекрови практически весь флуоресцентныйсвет от молекул ФС, связанных с альбумином. Флуоресценция в буферном растворе вдесятки раз меньше, чем в растворе белка,Таким образом, ФС позволяет в сыворотке крови измерять характеристики именно молекул альбумина.П р и м е р 2, В табл, 1 приведеназависимость интенсивности флуоресценции ФС (В = й(С 2 Н 5)2, В 1 = Н, В 2 = СООН) отего концентрации в разведенных (Х = 2000)сыворотках крови с разным количествомальбумина. Для разведения использован буферный раствор: 10 мМ трис.НС, рН 7,6.В интервале концентраций 2400/Х -3600/Х мкМ интенсивность флуоресценцииФС не зависит от его количества, а отражаеттолько характеристики исследуемого объекта,П р и м е р 3. Измеряли СЕА предлагаемым способом и с помощью способа-прототипа в сыворотках крови 20 здоровыхдонорОв и 22 больных с синдромом гипербилирубинемии и с гнойно-септическимизаболеваниями.Для этого к 0,01 мл сыворотки кровидобавляли 2 мл буферного раствора (10 мМтрйс.НС, рН 7,4) и 0,03 мл 1 мМ раствораФС(В= й(СНЗ)2, В 1= Н, В 2 = СООН) вдимЕ1681266 воротки), сложного оборудования и дорогостоящих реактивов. Способ позволяет определить такой важный параметр, каксвязывающая емкость альбумина. Предла 5 гаемая методика, не уступая прототипу поточности выявления снижения СЕА, значительно сокращает время проведения и упрощает анализ, позволяет проводить его вавтоматическом режиме. При этом для вы 10 полнения 1000 анализов достаточно 11 мгфлуоресцентного соединения,Формула изобретенияСпособ определения связывающей емкости альбумина в сыворотке крови путем15 добавления к разбавленной сыворотке вещества, взаимодействующего с альбумином, с последующим измерениемколичества получаемого продукта и сравнением его уровня с контрольной сывороткой,20 о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюупрощения и ускорения способа, в качествевещества, взаимодействующего с альбумином, используют соединение общей формулы25 30 40 Таблица 1 Р 1 и Г 2 -интенсивности флуоресценци ФС в сыворотках крови, разведенных в Х раз, с содержанием альбумина соответст венно 51 и 34 г/л,тилформамиде, перемешивали и измеряли интенсивность флуоресценции раствора при 550 нм(возбуждение при 420 нм) в кювете 1 см на медицинском флуориметре ФМ-Ц. Конечное разведение сыворотки Х =200, концентрация ФС 3000/200= 15 мкМ.Способ измерения СЕА при помощи красителя конго красного (прототип) известен.Параллельно аналогичным образом обрабатывают стандартный 5 ф,-ный раствор альбумина. СЕА выражают в виде процентного соотношения интенсивности флуоресценции ФС (предлагаемый способ) или оптической плотности конго красного (прототип) в исследуемом образце и в стандартном альбумине,Полученные данные представлены в табл. 2,Как видно, среднее снижение СЕА весьма значительно (в 2,5 раза) в этой группе больных и получается практически одинаковым при измерении обоими методами: известным (прототип) и предлагаемым. Однако предлагаемый способ намного проще и быстрее.Интервал измерений СЕА для здоровых людей составляет 85-111)ь, тогда как в группе больных - от 20 до 82, В связи с этим величину 85)( целесообразно считать нижней границей нормы,Сравнение предлагаемого способа со способом-прототипом по числу и длительности стадий представлено в табл. 3.Таким образом, по способу-прототипу из 1478,5 мин затраты времени на проведение операций составляют 8,5 мин - почти в 2,5 раза больше, чем по предлагаемому способу, причем для инкубирования проб требуется 30+ 1440 мин.Предлагаемый способ не требует больших объемов крови (достаточно 0,01 мл сыгде й - й(СНз)2: М(С 2 Н 5)2:В 1 - Н, СООН;Я 2 - ОН, СООН,сыворотку крови разбавляют в 120-2000 раз, соединение добавляют в концентрации 2402/Х - 3600/Х мкМ, где Х - разведение сыворотки, и измеряют интенсивность флуоресценции в области максимума свечения полученного раствора,) Среднее + ошибка среднего Таблица 3 Стадии и о есса Длительнасть,мин 0,5 0,3 0,2 2,0 0,5 3,5 0,5 0,530,0 Составитель А. Агуреев Редактор Л, Веселовская Техред М,Моргентал Корректор С, ШевкунЗаказ 3310 Тираж 390 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 По предлагаемому способу1. Разведение сыворотки крови2, Добавление ФС3. Перемешивание4. Измерение интенсивности флуоресценцииотносительно эталона5. Оценка отклонения от нормыВсего: По способу-прототипу1, Приготовление рабочего раствора красителя2. Добавление раствора красителя к сыворотке3. Инкубирование при 37 С4. Добавление насыщенного раствора хлористого натрия5. Перемешивание6. Инкубирование при 37 С7. Перемешивание8, Фильтрование9, Разведение10, Измерение оптической плотности 11, Оценка отклонения от нормыВсего: 0,30,21440,00,25,С0,31,0О,51478.5