Бнйлиотека л. в. воробьев

ОП ИСАН ИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВМДЕТЕЛЬСТВУСоюз Советских Социалистических РеспубликъЦ Зависимое от авт. свидетельства. Кл, А 611 23/00 8/31-16) исоединением заявки Приори Комитет по дел зооретеиий и открытий ДК 576.8.097.2 (О плетень9 при Совете МинистСССР 9.1 Ч.19 Авторизобретения Вор бьев явител СПОСОБ ОПРЕДЕ Я АНТИГЕН Заявлено 30.Х 1.1970 ( 16025 Опубликовано 26.1.1973, Бю Дата опубликования описа Изобретение относится к области медицины,а именно к области иммунологических методов исследования.Известен способ определения антигена путем обработки его иммунной сывороткой, меченой флуорохромом. Результат реакции оценивают путем просмотра препарата в люминисцентном микроскопе, в ультрафиолетовыхлучах,Однако известный способ определения аптигена не обеспечивает высокой чувствительности реакции и может быть использован только для определения корпускулярных антигенов.Цель изобретения - увеличение чувствительности реакции и определение корпускулярных и растворимых антигенов. Это достигается тем, что к сыворотке добавляют меченыйфлуорохр омом гомологичный антиген, комплекс антитело - меченный антигерои отделяют 20от свободного меченого антигена диск-электрофорезом в акриламидном геле, и результат учитывают по интенсивности свечения меченого антигена при облучении геля ультрафиолетовыми лучами. 25П р и м е р. Для испытания чувствительности предлагаемого способа в качестве неизвестного антигена используют традиционный объект иммунологии - альбумин человеческой сыворотки. Это определяет выбор специфической 30 2индикаторной системы. Она состоит из человеческого сывороточного альбумина, меченого изотиоци анатом флуоресцеина и сыворотки, преципитирующей белок человека. Окрашенный известным способом альбумин фильтруют через колонку с сефадексом.т, предварительно ур авновешенную электродным буфером. Таким образом, одновременно с освобождением альбумина от избытка флуорохрома (флуоресцеинизотиоцианата натрия) происходит замена физраствора электродным буфером. Элюат собирают в отдельные пробирки порциями по 1,0 - 1,5 мл. Наиболее ярко окрашенную порцию элюата обозначают как раствор меченого альбумина. Содержание белка в растворе определяемое по Лоури, составляет 4 - 5 мг/мл.Затем приготавливают столбики 7%-ного акриламидного геля, используя для мелкопористого геля трис-буфер с рН 7,5, для крупно- пористого геля трис-буфер с рН 5,5. В качестве электродного буфера используют трис-верональный буфер с рН 7,0.Приготовив гели и раствор меченого альбу- мина, приступают к определению его рабочей дозы. Для этого последовательно приготавливают разведения меченого альбумина, 0,05 или 0,1 мл каждого разведения наносят на столбики геля и проводят электрофорез. После окончания электрофореза гели просматривают336904 10 Предмет изобретения Составитель С, Щенева Техред Г. ДворинаКорректоры: Л, Царьковаи Н. Аук Редактор Н. Цалихина Заказ 669/1 Изд. Мо 210 Тираж 467 ПодписноеЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/6 Типография, пр. Сапунова, 2 в ультрафиолетовом свете и отмечают последнее разведение антигена, еще дающее четкую светящуюся полосу в нижней части геля. Это разведение принимают за рабочую дозу меченого антигена.Затем определяют рабочую дозу гомологичной меченому антигену сыворотки, преципитирующей человеческий альбумин. Смешивают 0,05 мл каждого разведения сыворотки с рабочей дозой меченого альбумина. По 0,1 - 0,15 ил смеси наносят на гели и проводят электрофорез.Комплекс антитело - меченый альбумин в силу большой величины и маленького заряда остается в верхней части геля, в то время как свободный меченый антигвн перемещается в его нижнюю часть.После окончания фореза гели просматривают в ультрафиолетовом свете и отмечают последний гель, где светящаяся полоса находится в верхней части геля, Это и есть рабочая доза сыворотки, т. е. минимальное количество сыворотки, полностью связывающее рабочую дозу меченого антигена.Далее 0,05 мл раствора определяемого альбумина на электродном буфере смешивают сначала с рабочей дозой преципитирующей сыворотки, затем добавляют рабочую дозу ме.чвного альбумина. 0,15 мл смеси наносят на гели и после электрофореза учитывают ре зультат реакции по интенсивности свечениясвободного и связанного меченого альбумина при облучении геля ультрафиолетовым светом. Способ определения антигвна, основанныйна его взаимодействии со специфической го мологичной сывороткой в реакции иммунофлуоресценции, отличающийся тем, что, с целью увеличения чувствительности реакции и определения корпускулярных и растворимых антигенов, к сыворотке добавляют меченый флу орохромом гомологичный антигон, комплексантитело - меченый антиген отделяют от свободного меченого антигена дискэлектрофорезом в акриламидном геле, и результат учитывают по интенсивности свечения связанного и 25 свободного меченого антигена при облучениигеля ультрафиолетовыми лучами.