Способ определения размеров циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК тят 5 6 01 й 33/535 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОПРИ ГКНТ СССР ТЕТРЫТИ Я Е ве крупных ЦИ относительного та и изменению твора,осу Способзом,твляют следующим о ПИСАНИЕ ИЗО АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) 1-й Ленинградский медицинский институт им. акад. И.П,Павлова(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРА ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ 8 СЫВОРОТКЕ КРОВИ(57) Изобретние относится к медицине и может быть использовано в клинической и теоретицеской иммунологии для определения Изобретение относится к медицине, иммунологии и может быть использовано поиизучении патогенеза различных заболеваний,Цель изобретения - повышение точности способа и обеспечение воэможности одновременно регистрировать распределениециркулирующих иммунных комплексов(ЦИК) по размерам,Целк достигается тем, что согласно известному способу определения размеровЦИК в сыворотке коови путем их осажденияи последующей регистрации осаждениемакромолекулярных структур производятраствором ПЭГ 6000 в конечной концентрации 0,1-0,5;4. а регистрацию осуществляютизмерением спектра оптического смещениясвета (СОСС), рассеянного пробой до и после осаждения, причем размеры макромолекулярных структур определяют по ихгидродинамическому радиусу, а о количест 1673972 А имллунных комплексов в сыворотке крови. Целью изобретения является повышение точности определения крупных иммунных комплексов, их относительного количества и размеров, Цель достигается тем, что осаждение макромолекулярных структур производят раствором полиэтиленгликоля в конечной концентрации 0,1 - 0,5, регистрацию осуществляют по измерению спектра оптического смешения света, рассеянного пробой до и после осаждения, Размеры макромолекулярных структур определяют по их гидродинами" ескому рад усу, О ко личестве крупных иммунных комплексов судят по изменению оптической плотности раствора. 5 табл,К судят по изменению их вклада в рассеивание свеоптической плотности расК исследуемой сыворотке крови добавляют раствор ПЭГ 6000 в количестве, эквивалентном количеству исследуемой сыворотки (в данном случае 0,2 мл), с тем, чтобы конечная концентрация ПЭГ составила 0,1-0,5, После добавления ПЭГ сыворотку оставляют на 24 ч при 22-24 С, затем исследуемые образцы центрифугируют .три 6000 об/мин в тече лие 30 мин, После центрифугироеаня супернатант разводят 0,9",ь-ным физиологическим раствором в 25 раэ и поме цают исследуемую жидкость в количестве 0,5 мл в кювету, Сравнение производят с сывороткой кро. ви, к которой вместо ПЭГ 6000 добавляюттакое же количество (0,2 мл) физиологического раствора, после чего также выдерживают 24 ч при 22 - 24 С, центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и разводят супернатант в 25 раз, После этого помещают раствор в количестве 0,5 мл во вторую кювету,Измеряют СОСС по гетеродинной схеме и по полученным гистрограммам раствора беэ ПЭГ и с ПЭГ, сравнивая их, определяют изменение относительного вклада крупной компоненты, а также следят за степенью агрегационных изменений в растворе под действием ПЭГ, Одновременно определяют средний размер по системе (гидродинамический радиус) этой крупной компоненты, по которому можно судить о размере крупных ЦИК, и проводят измерение оптической плотности раствора по известному способу для количественной характеристики содержания крупных ЦИК в сыворотке крови.П р и м е р 1, Из 4-х больных хроническим активным гепатитом крупные ЦИК размером 3500 нм с относительным вкладом в рассеивание света 30 в количестве, соответствующем 150 ед, оптической плотности (ОП), были обнаружены только у одного больного, причем именно у этого больного отмечалось наиболее тяжелое течение заболевания, В то же время контрольное применение известного метода определения ЦИК выявило лишь незначительную разницу в ОП растворов, Данные приведены в табл.1.П р и м е р 2, Установлено, что при использовании раствора ПЭГ 6000 в конечной концентрации 0,1-0,5 осаждаются именно крупные ЦИК, не внося значимых изменений в исследумый образец,Распределение белковых частиц в сыворотке крови по размерам и относительному вкладу в рассеивание света, в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000, у больного хроническим гепатитом приведено в табл,2.Как видно из табл,2, начиная с концентрации ПЭГ 6000 1;6, вновь увеличивается вклад крупных частиц. Минимальные изменения в составе частиц, позволяющие выделить крупные ЦИК, наблюдаются при применении концентрации ПЭГ 6000 0,1 -Отсутствие значительных возмущений в сыворотке крови при применении концентрации ПЭГ 6000 0,1-0,5 контролировали не только по изменению вклада частиц в рассеивание света, но и путем определения общего содержания белка, отдельных фракций и содержания основных классов иммуноглобулинов.Общее содержание белка в надосадке в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.З.Содержание иммуноглобулинов класса А, М, С в надосадке в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.4.Как видно иэ приведенных данных, минимальные изменения наблюдаются при концентрации ПЭГ 6000 0,02 - 0,5, в то время как дальнейшее увеличение концентрации ПЭГ 6000 приводит к значительному изменению количественных соотношений как иммуноглобулинов, так и общего белка,Изменение ОП растворов в зависимости от применяемой концентрации ПЭГ 6000 приведено в табл.5,При определении ОП раствора при использовании высоких концентраций ПЭГ 6000 изменение ОП происходит за счет изменения общего количества белка (см. табл,З),При исследовании 100 проб от больных хроническим вирусным гепатитом по извет- ному способу ЦИК были обнаружены у 90 больных, причем их уровень в сыворотке крови составлял в среднем 0,184 +0,04 ед. ОП. В то же время предлагаемый способ позволял установить, что крупные иммунные комплексы отмечались в 53; больных и их уровень был 0,147+6,01 ед. ОП, в то время как у остальных 37 больных в сыворотке крови выявлялись только мелкие и средние комплексы. Таким образом, известный способ уступает предлагаемому в выявлении крупных ЦИК, играющих ведущую роль в патогенетическом процессе.В исследуемых осадках определяли структуры сгидродинамическим радиусом с размерами от 5550 до 617 нм, ошибка измерения 1,5; в различных соотношениях, в среднем 1600+200 нм,45 50 55 5 10 15 20 25 30 35 40 Формула изобретения Способ определения размеров циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови путем обработки полиэтиленгликолем 6000, отделения супернатанта с последующей регистрацией, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа и обеспечения воэможности одновременно регистрировать распределение циркулирующих иммунных комплексов по размерам, для обработки используют полиэтиленгликоль в конечной концентрации 0,1-0.5 в эквивалентном по объему соотношении, обработку проводят1673972 Таблица 1 блица 2 Таб Табли онор 24 ч, а затем отделяют супернатант, регистрацию проводят путем измерения спектра смещения света, рассеянного пробой до и после обработки, с одновременной регисти м е ч а н и е, Ошибка метода +025 г/л,рацией оптической плотности раствора, приэтом в качестве пробы сравнения используют сыворотку крови, обработанную физиологическим раствором. 1,19 1,02 0,641 б 73972 Таблица 5 Составитель А. АгуреевТехред М,Моргентал Корректор Э, Лончакова Редактор А, Огар Производственно-издательский комбинат "Патент", г, ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 2915 Тираж 390 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5