Способ получения сыворотки крови птиц

ния в месте разветвления ключиц, уГирают пружинные зажимы с ватногофильтра и одного селиконового шланга,идущего к Флакону, иглу в горизон"тальном положении продвигают в грудобрюшную полость до попадания в полость сердца, при попадании иглы вполость сердца рукой, в которой находится игла, всегда ощущается сердцебиение, и кровь, пульсируя, поступает во флакон. Обескровленную птицупереносят на конвейер,Флакон заполняют крогзью до 65-75%его объема в два этапа,: первой иглой.набирают 60-75 мл крови и ставятов теплую воду (температура 37-40 С)под углом 35 О на 30-40 мин. За этовремя образовавшийся сгусток кровиотслаивается от поверхности стекла 20флакона самостоятельно нли путем лег "кого вращательного движения Флаконаи отделяется незначительное количество сыворотки, Второй иглой набираюткровь до 160-185 мл и выдерживают в 25водяной бане при тех же условиях,что и на первом этапе, до отслоениясгустка крови от поверхности стеклафлакона. Двухэтапное заполнение Флаконов по описанной технологии обусловливает максимальное отделение сыворотки от сгустка крови. Нац пламенем спиртовой или газовой горелкиудаляют пробку системы взятия кровис флакона и заменяют ее другой сте 35рильной пробкой,Отделение сыворотки осуществляютметодом центрифугирования флаконов,заполненных кровью, при 20002200 об/мин в течение 25-30 мин. Ыы 40ход сыворотки 4050%. При хранениипо производственной необходимостиФлаконы с кровью выдерживают до центрифугирования в воде с кусочкамильда (температура 6-10 С) не более1.чСбор отделившейся сыворотки проводят стерильной системой для сборасыворотки крови, Перед сбором сыворотки ". орлышки флаконов обрабатываютспиртом. Кровоостаыавлггвающим зажггмом перекрывают селиогговыи шланг,идущий к сосуду для сбора сыворотки,Над пламенем удаляют пробку с Флакона с отделившейся сывороткой и вводят трубку для отсоса сыворотки, неразрушая сгусток крови. Прикрываютгорлышко Флакона пробкой с отверстием, заполненным ватой, Затем в сосу"= де для сбора сыворотки создается от"рицательное давление -0,15-0,2 атмс помощью разряжающего мембранногокомпрессора (штуцер - трубка из нержавеющей стали). Шланг, идущий откомпрессора, надевается на селиконовую трубку ватного фильтра. флаконыс отделившейся сыьороткой ставят вслегка наклонном положении, и трубкус защитным зонтиком на всасывающемконце постепенно опускают по стенкефлакона до границы раздела сывороткии сгустка крови. Защитный зонтик навсасывающем конце трубки профилактирует попадание в сыворотку Форменныхэлементов крови и позволяет проводить наиболее полно ее сбор. Посредством кровоостанавливающего зажимарегулируют скорость отсоса сыворотки,Освобождение сыворотки от попавших в нее Форменных элементов кровипроводят методом центрифугированияфлаконов с собранной сывороткой при1000 об/мин в течение 10-15 мин,Осаждение и удаление из сывороткикриоглобулинов проводят следующимобразом. Освобожденную от Форменныхэлементов крови сыворотку подвергаютоглубокому замораживанию при -20 С втечение 48 96 ч во флаконах емкостью250 мл. После оттаивания (при 4-6 С)в сыворотке вьгпадает осадок криоглобулинов, который удаляют центрифу"гированием флаконов с сывороткой при1500 об/мин в течение 10-15 мин,Стерилизацию сыворотки после удаления криоглобулинов проводят методом фильтрации ее через набор мембраиных Фильтров фирмыМиллипор сдиаметром пор 1,2 г 11 - 0,22 1. Сыворотку разливают по 50-100 мл и этикируют. Расфасованную сыворотку хранят при 4 С После проверки на стеорильность, ростовые свойства и насодержание специфических антител сыворотка.может быть использована длякультивирования клеток животных тканей,П р и м е р 2. Сравнительноеизучение отделения сыворотки методомцентрифугирования флаконов заполненных кровью кур в один и два этапа (табл.1), где п - число флаконовв опыте; х - среднее арифметическое;ш - средняя ошибка среднего.арифметического).Б опыт взято 12 Флаконов емкостью250 мл, заполненных кровью до 65-75%их абьема В адин этап (Вариант опьРфта 1), и 22 флакапа, заполненных кровью до 65-75% их объема в два этапа:до 25-30% на первом этапе и да 65: 75% их объема на втором этапе (вариант опыта 2), Заполнение флаконовкровью проводится при условиях, указанных в примере 1. Отделение сыворотки проводится методом центрифу" 1гирования флаконов с кровью при2000 об/мин в течение 30 мин,Как видно из табл.1, выход сыво"ротки при центрифугировании Флаконов,заполненных кровью в один этап, не 5значителен - 10,84+1,427 к объемукрови и резко возрастает до 41,51++1,05% при центрифугиравании Флаканов, заполненных кровью кур в дваэтапа,2 СП р и м е р 3. Сравнительное изучение взятия крови из сердца кур попредлагаемому и известному способам(табл.2)По предлагаемому способу:пример 1/проведено взятие 2,850 л крови у16 кур с живой массой 2,5-4,2 кг за1 ч 50 мин без помощника. Зачел/чполучено 1,550 л крови (вариант опьгта 1). 3(По известному способу берут кровьу 6 кур с живой массой 2,5-3,9 кг,Получено 0,395 л крови зач Взятиекрови проводится с помощником, поэтому зачел/ч получено 0,2 л крови, что почти в 8 раз меньше, чем попредлагаемому сгасобу. Как видно из табл.2, отношение взятой крови к живой массе кур по 4 С известному способу составляет лишь 1,98+0,11%, а по предлагаемому спо сабу 5,50+0,08%П р и м е р 4, Сравнительноеизучение отдегения сыворотки крови 45 кур по предлагаемому и известному способам (табл. 3).По предлагаемому способу (приме рыи 2) проведено отделение сыворотки методом центрифугиравания Фла 50 конов емкостью 250 мл, заполненных кровью в два этапа до 65-75% их объе ма, при 2000 об/мин в течение30 мин. В опыт взято 22 Флакона с общим объемом крови 3,785 л. Выход 55 сыворотки 1,570 л(вариант опыта 1).По известному способу сыворотку отделяют методам отстоя крови в стеклянных пробирках на 20 мл, В .опыт взято 16 пробирок, в, каждую из которых и; " литпа 15 мл крови, Общий объем крови в пробирках 0,240 л. Бремя отстоя 5 ч, Выход сыворотки 0,041 л,Из табл 3 видно, чта выход сыворотки па предлагаемому способу ее отделения достаточно велик: в среднем из одного Флакона отсосана 71,36+ +1,95 мл сыворотки крови. Чтобы получить такое количество сыворотки по известеому способу необходимо за полнить кровью 25-30 пробирок, что свидетельствует о низкой технологичности и незначительном отделении сы варатки ат сгустка,П р и м е р 5. Сравнительное изучение ростовых свойств сывороток крови кур, крупного рогатого скота и эмбрионов коров при культивировании клеток РК(табл.4).Перевиваемая линия клеток РК получена из почки поросенка, завезена из Португалии и поддерживается на среде, состоящей из 90% среды Игла МЕГ с глутамином и 10% сыворотки крови эмбрионов коров. Посев клеток РКпроводят в стеклянные матрасики емкостью 200 мл, В каждый матрасик вносят па 30 мл клеточной взвеси в культуральной питательной среде с концентрацией 54,22+1,07 тыс, клетак/мл. Посевная доза на 1 матрасик 1626,65+32,05 тыс.клеток. Состав культуральнай питательной среды: 90-98% среды Игла МЕМ с глутамином, 2-10% сыворотки крови кур, каннамицина сульфата из расчета 0,1 мг/мл., Клетки помещают в термастат при 37 С.В качестве контроля служат клетки РК, выращеннье при тех же услови ях в присутствии сывороток крови крупного рогатого скота и их эмбрио нав, которые получены на базе Казан ского мясокомбината, Оценку роста клеток в динамике проводят па индексу пралиферации.Из табл.4 следует, что лучшие результаты па индексу пролиферации получены при 57-ной концентрации сыворотки крови в культуральнай питательной среде. Индекс пролиферации клеток РК, выращенных в присутст вии 57. сыворотки кур, через 96 ч роста выше (4,92), чем в присутствии сыворотки крови крупного рогатого1611339 Таблица 1 7 Отношение отсосан-, ной сыворотки к Вариантопыта тсосано сыворотки рови из 1 флакона,ем крови во конах, млоличесто флако ооъему крови 7. ов Х ш 10 841 4 41,51 1,0 19,17+2,6 71,36+1,9+1,6 +2,2 72 скота (3,59) и сыворотки крови эмбрионов коров (4,03).Культура клеток РК 15 при указан ной посевной концентрации клеток, выращенная на среде Игла МЕМ с 2-5 Е сыворотки кур при исследовании под микроскопом через 72-96 ч образует плотный, хорошо выраженный монослой, клетки несколько крупнее, чем в присутствии сыворотки эмбрионов коров но не теряют четкости границ, прозрачности и конфигурации. При культивировании этих клеток на среде, содержащей сыворотку крови крупного ро гатого скота, клетки образуют тяжи теряют четкость границ и прозрачность,П 1 и м е р 6Сравнительное изучение ростовых свойств сывороток кро ви кур, крупного рогатого скота иэмбрионов коров при культвированииклеток ПЭК (первично-трипсинизированных клеток почек эмбриона коровы).Трипсинизацию почек эмбриона (до1,5 кг) коровы проводят по известнойметодике. Суспензию этих клеток вносят в стеклянные матрасики емкостью200 мл по 30 мл с концентрацией500000 клеток/мл. Состав культурапьной среды: 957. среды Игла МЕМ с глутамином, 57. сыворотки крови кур,каннамицина сульфата из расчета0,1 мг/мл. Клетки помещают в термостат при 37 С. Смену среды проводятчерез 24 ч после посева клеток,Контролем служат эти же клетки,выращенные при тех же условиях вкультуральной питательной среде состава: 907. среды Игла МЕМ с глутамином, 107. сыворотки крови крупного рогатого скота или их эмбрионов, каннамицин сульфата из расчета 0,1 мг/мл,Клетки ПЭК в присутствии сыворот" ки крови кур и эмбрионов коров образуют полный монослой через 72 ч, а в присутствии сыворотки крови крупного рогатого скота через 96 ч после их посева. При световом микроскопиро вании существенных различий в морфологии клеток ПЭК, выращенных в присутствии сыворотки крови кур и эмб рионов коров, не обнаружено, а у клеток, выращенных в присутствии сыво ротки крови крупного рогатого скота, отмечена незначительная стертость границ. Формупа изобретения Способ получения сыворотки крови птиц, включающий фиксацию птицы на столике, взятие крови из сердца иглой в сосуд, отделение сыворотки, центрифугирование ее, освобождение от криоглобулинов и стерилизацию, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения производительности способа и улучшения качества целевого продукта, Фиксация птицы производится наклонно в желобообразном столике, взятие крови проводят асептически последовательно двумя иглами, вначале одной иглой до заполненияг 25 307. объема сосуда, затем выдержи" вают кровь при 37-40 С и второй иглой заполняют сосуд до 65-75% объема, отделение сыворотки осуществляют центрифугированием и отсасыванием, а стерилизацию проводят путем мембранной Фильтрации.10 1611339 ем взятой Вари опыт о вая масср, кг ичесто кур 178,13+8,54 65 э 83 бэб 5,50+0,0 1,98+0,3,237+0,141 3,200+0,203 а.блица оличеств асано ви из вора флак м крови аконов,обирокэш коне,пр ирки,Х+ ш 1, 36+1, 95 2,57 0 э 14 41,51+1,05 17,12+0,92 2,05+2,205,00 и ц а Вр Числ оличест о сывото клет атрасик рост ет рови счет кле клеток ови в ультуальной редеэ% 5 1088,89+42,22 5 894,44+26,22 5 1138,89+33,37 5 1783,33+42,89 5 1277,78+41,11 5 1888,89+73,10 5 1640,00+65,33 5 1808 э 33 тбэ 33 5 2258,33+85,36 5 2497,78+102,67 5 2148,00+53,33 5 3208,89+116,89 5 4361,11+121,11 5 3111,11+93,89 5 3819 э 44+230,56 5 3027,78+73,89 5 2583,33+2,78 5 3055 э 56 Л 81 э 58 5 5262,22+90,62 5 4600,00+98,67 5 4853,33+66,49 5 7755,56+133,33 5 5577,78+98,67 5 6702 э 22+144 э 89 СККСККРССКЭКСККСККРССКЭК 0,67 Контрола0,55 0,70 1,10 0,79 1,16 1,011,39 1,54 1,32 онтролее трол онти 2,68 1,91 2, 35 1,86 1,591,88 3,24 2,83 2,98 4,77 онтри онтрол Контроль и 5 нтро,12 СККСККРССКЭКСККСККРССКЭКСККСККРССКЭКСККСККРССКЭКСККСККРССКЗКСККСККРССКЭК 1 куры, млВУФВ ВЗРЮВУФФФФЭФФФ Таблица 2 тношение взятой крои к живой массе курэ% Отношение отсосаннойсыворотки к объемукрови, % ндекс пролиферацииоличество выросших клеток оличество посеянных кл1611339 Продолжение табл,4 КК ККР ХЭК 10 онтрол11 Контроль СККР СКЭК СКК СККР СКЭК онтро11 СККСККРСКЭК,50 ,02 Контроэ 11ви кур; СККРСкота; СКЭК - сыв в ыворотк е: СКК сывкрупного эмбриоио тка к атого имеча отка кров мишин ец Заказ 3783ВНИИПИ Государственного к113035, М 46 Подписноебретениям и открытиям при ГКНТ СССаушская наб., д. 4/5 4 р етапо и а Ж,оиэвсдственно-издательский комбинат Патент", г,ужгород 1 ул. Гагарина,10 4556,56+146,675422,22+114,67611,1 1+151,116257,78+.135,114977,78+79,115120,00+114,678000,00+55,565844,44+137,786560,00+129,784071,11+90,675688,89+114,676533,33+129,78 Составитель И.Иарченкоедактор И,Горная Техред Л. Олийнык . Корректо 2,80 3,83 3,76 3,85 3,06 3,15 4,92 3,59 4,03