Способ определения токсичности зернопродуктов и комбикормов

(51)5 С 12/4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИН АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ венВ,про ТИ те зех вано в частно зерна,аботки енных одержа(микоповы- щение ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТГЮ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР. (71) Всесоюзное научно-производстное объединение комбикормовой промышленности "Комбикорм"(56) Рухлядева А.П., Полыгалина ГМетоды определения активности гидлитических ферментов. М,: Легкаямьнипенность, 1981, с. 287,Тутельян В,А., Кравченко Л.В,Микотоксины. М.: Медицина, 1985.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСЗЕРНОПРОДУКТОВ И КОМБИКОРМОВ(577 Изобретение относится к бионологии и может быть использованокормопроизводстве, в частности вопределении токсично ти зерна, раличных продуктов его переработки,комбинированных кормов, пораженнь Изобретение относится к б нологии и может быть использ области кормопроизводства, в ти в определении токсичности различных продуктов его пере комбинированных кормов, пора микроскопическими грибами и щих их токсические метаболит токсины),Целью изобретения являетс аение чувствительности и. сок длительности,микроскопическими грибами и содержащих их токсические метаболиты (микотоксины). Целью изобретения являетсяповышение чувствительности и сокращение длительности. Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментный препарат глюкоамилазы - глюконигрин Г 20 х, которыйинактивируется в различной степенипри инкубировании с экстрактами изтоксичных кормов. Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилазы - глюконигрина Г 20 х под действием как очищенных чистых препаратов микротоксинов, так и экстрактов из кормовыхсредств, инфицированных микроскопическими грибами и содержащих микотоксины. Инкубирование экстрактовмикотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42 С в течение 10-15 мин,а о токсичности судят по снижениюактивности фермента. Продолжительность анализа 3-4 ч. 2 табй. Для этого в качестве тест-объекта используют отечественный ферментный препарат глюкоамилаэы - глюконигрин Г 20 х, который инактивируется в различной степени при инкубировании с экстрактами иэ токсичных кормов.Определение токсичности основано на снижении активности фермента глюкоамилаэы - глюконигрина Г 20 х под действием как очищенных чистых препаратов микотоксинов, так и экстрактов из кормовых средств, инфицированныхВ50 микроскопическими грибами .и содержащих микотоксины. Инкубирование экстрактов микотоксинов и тест-объекта проводят при 38-42 С в течение 10 о5 15 мин, а о токсичности судят по снижению активности фермента, Продолжительность анализа 3-4 ч.П р и м е р. К .навеске измельченного зерна, продуктов его переработки (отруби, мучки) или комбикорма массой 50 г приливают 150 смз ацетона, встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1 ч, Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в колбу, куда добавляют 50 см гексана и 100 см 1%-ного раствора БаС 1, Содержимое колбы перемешивают в течение 1 мин, а затем выпивают в делительную воронку, После расслоения жидкости 20 верхний (гексановый) слой отбрасывают, а нижний (водно-ацетоновый) переносят в другую делительную воронку и экстрагируют токсические вещества хлороформом трижды (50, 20, 20 см). Хлороформные экстракты объединяют, пропускают через фильтрат с безводным сульфатом натрия и выпаривают в выпарительной чашке на водяной бане (50-60 С) досуха. Сухой остаток ацетоном количественно переносят в мерную колбу взаимностью 50 см и доводят до метки.0 токсичности исследуемого экстракта судят по изменению активности глюкоамилазы - глюконигрина Г 20 х при добавлении в инкубируемый раствор 1 см экстракта. К контрольному раствору добавляют 1 см чистого ацетона.Активность глюкоамилазы определяют приятным глюкозооксидазным методом, основанным на специфическом определении глюкозы, образующейся при действии глюкоамилазы на раство 45 рймый крахмал.Активность глюкоамилазы в пред-лагаемом способе при воздействии экстракта из корма определяют следующим образом. К 10 см 17-ного раствора крахмала, нагретого до 42 С, приливают 5 смз раствора глюкоамилазы и 1 смз экстракта исследуемого корма, инкубирают смесь в термостате. при 42 С в течение 15 мин. Через 15 мин отбирают 1 см гидролизата 55 и кипятят 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры, вносят 3 смз раствора С согласно действующей методике, перемешивают, оставляют на 45 мин при комнатной температуре и в дальнейшем определение проводят согласно пейстячощему глюкозооксидазному методу,Для определения чувствительностии достоверности значения нижнегопредела снижения активности глюконигрина Г 20 х проведена метрологическаяоценка полученных данных, Снижениеактивности тест-объекта - глюконигрина Г 20 х достоверно устанавливается при концентрации глюконигрина от-8от 3,0 10 М, при этом отсчет определения токсичности производится с 207.потери активности фермента - деградации молекулы глюконигрина от действия токсического фактора,Сравнительная характеристика известных и предлагаемого методов определения токсичности и их пороговаяРчувствительность приведена в табл, 1.Из данных табл. 1 следует, чтопри действии экстрактов из кормов,зараженных продуцентами токсиновТ, Ф, охратоксина А, афлатоксинаБ активность глюкоамилазы достоверно снижается на 42, 29, 37 и 327, соответственно,Предлагаемый способ определениятоксичности определяет присутствиемикотоксинов в концентрации 10 10 мкг/пробу, что подтверждаетзначительно большую чувствительностьпредлагаемого способа, чем используемые в настоящее время биометоды,Лля сравнения существующих методов с предлагаемым готовили пробыдоброкачественного зерна, зерноотходов, комбикорма и такие же пробы,но содержащие определенное количество искусственно зараженного токсигеиными грибами-продуцентами токсиновТ, Фохратоксина А и афлатоксина В корма, которые были исследованы на токсичность (см. табл, 2).Из данных табл. 2 следует, чтомолекула глюкоамилазы - глюконигринаГ 20 х достоверно уменьшает каталитическую активность при действии экстрактов зараженных микотоксинами кормов - до 84% от исходной, что можетслужить тестом для определения токсичности, При понижении активностифермента от 207, н более пробы комбикорма или зернопродуктов считаютсятоксичными,5 164Использование молекуляр)1 ой моделидля оценки токсичности позволяетза 3-4 ч получить окончательныйрезультат, что позволяет считатьэтот метод экспрессным. Таблица 1 ароговая чувстпительнасть различима метадон апрслгленгог токсичности Гзкрптолсин 6 гбгкатаксии оИи кото кссг гг ТТест"обьекты Диительность анпсгнза, Каицентра- Оценкач ция в зкст- таксичрпкте ности24 4,20/21,0 КачсстОценка Концентрацияв экстракте Каипснтрапия Оценка п экстракте токснчкнасти ОгсеилатаксичКои цс игр з гпгпи зкстрзкте таксичпасти насти Качест,0/360веинаятокснч 30, 10/ 1 50, 5 Кпчсс г.ч ОО/325веннаяток сггч т 1 ачестнеиная,токсич Рыбы гуппи веннаятоксичио ио но но Белые мьювг: перорально поцконно виутрибрююинноКролики (конная проба) 315,0/787,0 Та лс400,0/1000 ЬОО,ОО,г 500,0 43 ч,оо/085,0 То ис 720,00/1800,0 468,00/1170,0 То пе 12, О/30,0 4,50/,2 То ке 72 72 129,0/325,0 -"- 62,0/55,0 45,0/112,0 4,50/11,2 7 сутили 68 ч 1,00/5,0 1,ОО/5,0 Нс определяетсяТоксич.16/5,8 . но 29, 107 14 5, 5 0,25/1,25 Клетки ХАО/3 103 пктипиосп,тгЧислитель - мингсьгаггьное лгчгггчество, выягсгясмас бгипгпгичесьзьпг тест-абьиктппц клетками КЛО, глюкагпггриипм 20 к в исследуемом корме, мкг/пробу, п знаменатель - тпт ье ппк,ззптель, мг;г/к г 1 ралуктз. Таблица 2 Влияние экстрактов из доброкачественных и токсичных комбикормови зернопродуктов на активность глюконигрина Г 20 х (исходнаяактивность 105,5 ед/мг белка) Довени цачмень корма (не токсично)105,4+0,56105,4+О, 4 2105,",+О, 24105,3+0,60104,9+0,64аженные микотокси61,2+0,3374,9+0,5166,5+0,4871 8+0 5767,5+0,3071, 7+0,0852, 7+О, 1174,9+О, 28 ное зер Нетокачест К 0,10 (в преде0,10 лах сшибО, 38 ки опытаО, 190,57ксично) КукурузаОтрубиКомбикор3Пшеница нами ( опродукт рма, за Ф Охрат 7 2 102 10 АфлатТ Ф Охрат чме 2 О 9 О 10 Формула изобретения Способ определения токсичности зернопродуктов и комбикормов,включающий экстрагирование токсинов,и комбико3,010 Р2,010син А 7,5син В 8 э1,910 з2,010син А 3.,син В 4,1888 6инкубацию их с тест-объектом с последующей оценкой токсичности, о т -л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и сокращения длительности, в качестветест-объекта используют ферментглюкоамилазу-глюконигрин Г 20 х в концентрации 10 -10 М, инкубацию про-4водят при 38-42 С в течение 1015 мин, а оценку проводят по снижению активности фермента.1641888 Продолжение табл,2 Кукуруза Отруби Комбикорм+ ФПробы комбикормов перед экстракцией ацетоном были просеяны поГОСТ 13496.8-72.Ъ Составитель И,ТарееваРедактор Т.ЛазоренкоТехред М.Дидык Корректор М.Максимншинец Тираж 373 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5