Способ получения простатической кислой фосфатазы

(19) 12 М 9/16 5) ГОСУДАРСТ ПО ИЗОБРЕ ПРИГКНТ С Г );а)914: )Д еl., Э ННЫЙ КОМИТЕТНИЯМ И ОТКРЫТИЯР ОБР ТЕНИЯ САНИЕ КОМУ СВИД Д.:"6881 МБЛОПХД ТЕЛЬСТВУ ВТОР(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) А,В,Соколов, К,М;Ледян, Л.П,Пашинцева, В.В.Светличкин и Л.П.Евсеев(56) Чгйо РКеппцп М., Кегпопеп ,К.зоакоп апб оЬагасегзабоп о 1 асЫ рпозрЬатазе агап ргояате. - СПпса СЬеглагу, 1978, М 3, р.466.-470.Авторское свидетельство СССР М 1576564; кл, С 12 М 9/16, 1988.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОСТАТИЧЕСКОЙ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ Изобретение относится к биологии и медицине и мажет быть использовано преимущественно для диагностики рака простаты, а также для дифференциальной диагностики других заболеваний с использованием иммуноферментного анализа наранних стадиях заболевания.Известно получение простатической кислой фосфатазы из ткани простаты, включающее гомогенизированйе ткани с твином . 80; центрифугирование; осаждение сульфатом аммония 300 насыщения, затем по. вторное осаждение центрифугированием; растворение осадка дистиллированной водой, длительный диализ (16 ч) и последующую очистку хроматографией и изоэлектрофокусирование.Однако конечный продукт получается с низкой удельной: активностью. Процесс получения препарата длителен из-за много 1747488 А 1 2(57) Использование: диагностика рака проста- ты, ранняя дифференциальная диагностика с использованием иммуноферментного анализа, Сущность изобретения: фракционирование спермоплазмы на фенилсефарозе и хроматографическая очистка фракций. Фракцию с кислой фосфатазой очищают методами аффинной хроматографии .и гельпроникающей хроматографией (ГПХ). Фракцию с простатическим специфическим антигеном очищают методом ГПХ. Из 20 мл1 спермоплазмы получают 2 мг кислой фосфатазы с удельной активностью 800 ед/мг и 1,45 мг простатического спецйфического антигена, 2 табл. кратного переосаждения, центрифугирования и длительного диализа.Известен также способ получения простатической кислой фосфатазы (далее по тексту ПКФ) из зякулята человека.Наиболее близким к предлагаемому является способ получения простатической кислой фосфатазы, включающий выделение из эякулята спермоплазмй центрифугированием, зкстракцию суммарной белковой фракции и ее хроматографическую очистку на фенилсефарозе СВ с элюцией снижающимся градиентом сульфата аммония от 1 до 0,1 М, на сефадексе 6-200 и на целлюлозе ДЕс элюцией возрастающим градиентом хлористого натрия от 0,05 до 1 М.Недостатками этого способа являются недостаточная экспрессность получения препарата из-за многостадийиой хроматографической очистки, большой расход сырья и реагентов. Кроме того, из одной пробыгель-филЬтрации на колонке с сефадексом6-100,П р и м е р. Берут 20 мл эякулята, Этотобъем центрифугируют 15 мин при 1000 одляотделения спермоплазмы от клеточныхэлементов эякулята. Затем к полученнойспермоплазме добавляют сульфат аммониядо концентрации 1 М (2,7 г) и проводят гидрофобную хроматографию на колонке с фенилсефарозой 6 -4 В (размер колонки 30100 мм), уравновешенную 1 М (МН 4)2504 в0,01 М трис-НС буфере (рН 7,4). Элюциюбелков проводят" ступенчатым градиентомснижающйхся концентраций сульфата аммония в.следующем порядке: 1 М - 150 мл;0,8 М - 100 мл; 0,5 М - 100 мл; 0,4 М - 300мл, далее 0.01 М трис-НС буфером (рН 7,4),Скорость элюции - 100 мл/ч, фракции по 15мл. В этой и последующих хроматографических процедурах полученные фракции анализируют в иммунопреципитационноманализе со специфическим тест-системамидля ПКФ и ПСА. Фракции, элюированные0,4 М (КН )2304, содержащие ПКФ-активностьбылислиты вместе и сконцентрированы ультрафильтрацией на фильтре УМ(Аписоп) до объема 12 мл, Фракции, элюиро-.ванные 0,01 М трис-Н С буфером и содержащие ПСА -активность, объединяют иконцентрируют, как указано выше, дообъема 12 мл,Сконцентрированные материалы подвергают анализу на содержание белка пометоду Лоури и полуколичественной оценкена содержание инградиентов (ПКФ и ПСА) впреципитацйонных тест-системах с чувствительностью 3 мкг/мл. Кроме того, на конечном этапе была определенаферментативная активность препаратаПКФ (данные приведены в таблице),. Таким образом, получают две фракции,одна из которых содержит ПКФ-активность,а другая - ПСА-активность, Далее берутодну из фракций, например содеркащуюПКФ-активность, диализуютв течение ночипротив 0,01 М трис-буфера (рН 7,4), Отдиализованный материал вносят в колонку сголубой сефарозой(размеры колонки 20160мм), уравновешенную тем.же буфером, Эл юцию проводят 0,01 М трис-НС буфером (рН7,4). В этих условиях ПКФ не сорбировалина колонке, Скорость колонки 20 мл/ч, фракции по 15 мл,ПКФ-активность обнаруживалась во5 фракцйях, не сорбировавшихся на обменнике, Эти фракции объединяют и концентрируют до объема 12 мл, как описано выше,Сконцентрированный материал подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом 6-150, уравновешенной 0,15 М такого дефицитного сырья получают толькоодин инградиент - ПКФЦелью изобретения является расширение технических возможностей способа путем одновременного выделения 5специфического простатического антитела.Поставленная цель достигается тем, чтосогласно способу, включающему получениеэякулята, выделение из него спермоплазмы,фракционирование на фенилсефарозе 6: 104 В и пбследующую хроматографическуюочистку полученных фракций, после фракциснирования на фенилсефарозе выделяютдве фракции, содержащие простатическуюкислую фосфатазу и простатический антиген, соответственно, и подвергают фракцию, содержащую простатическую кислуюфосфатазу хроматографической очистке наголубой сефарозе в 0,01 М трис-НС буфере,рН 7,4 и на сефадексе 6-150, а фракцию, 20содержащую простатический специфический антиген, подвергают хроматографической очистке последовательно насефадексах 6-150 и 6-100,Способ выполняют следующим образом.Получают эякулят человека, из которогозатем получают спермоплазму путем центрифугирования эякулята. Затем к спермоплазме добавляют сульфат аммония 30(КН 4)2504) до концентрации 1 М (2,7 г) ипроводят гидрофобную хроматографию наколонке с фенилсефарозой 6 -4 В, Элюциюбелков проводят ступенчатым градиентомснижающихся концентраций сульфата аммония. Затем фракции, элюированные 0,4 М-слйвают вместе и концентрируют ультрафильтрацией, Фракции, элюированные 0,01М трис-НС буфером и содержащие ПСА-активность, объединяют и концентрируют ультрафильтрацией. Затемфракцию,содержащую ПКФ-активность, диализуютпротив 0,01 М трис-буфера и вносят в колонку с голубой сефарозхой, уравновешенную 45тем же буфером. ПКФ-активность обнаруживалась во фракциях, не сорбировавшихсяна обменнике. Эти фракции объединяют иконцентрируют, Сконцентрированный материал подвергают гель-фильтрации на коланке с сефадексом 6-150, уравновешенной0,15 м раствором КаС в 0,01 М трис-НСбуфере.Для дальнейшей очистки ПСА сконцен- .. трированный материал наносят на колонку 5с сефадексом 6-150, подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом, уравновешенной 0,01 М трис-НС буфером. Фракции,содержащие ПСА-активность объединяют,концентрируют и повторно подвергают(рН 7,4) (размер колонки 25 1100 мм). Скорость элюции составляла 15 мл/ч, фракции по15 мл. Фракции, содержащие ПКФ, объединяют и концентрируют вышеописанным ме-. 5тодом,При электрофорезе (ЭФ) в полиакриламидном геле (ППАГ) в присутствии додецилсульфата натрия выявлялась одна белковаяполоса, соответствующая по молекулярной 10массе субьединице ПКФ, что свидетельствует о чистке полученного препарата.Для. дальнейшей очистки фракции, содержащей ПСА-активность, сконцентрированной после гидрофобной хроматографии, 15материал наносят на колонку с сефадексом6-150 (размер колонки 20 х 1 100 мм), уравновешенную 0,01 М трис-НСбуфером рН 7,4),содержащим 0,15 М МаС и подвергаютгель-фильтрации. Элюцию проводят со скоростью 15 мл/ч, собираютфракции по 15 мл,Фракции, содержащие ПСА, объединяют,концентрируют до обьема 12 мл и повторноподвергают гель-фильтрации на колонке сефадекса 0-100. При электрофорезе этого 25материала в полиакриламидном геле в присутствии БОЯ выявлялась одна белковая полоса, соответствующая молекулярной массе-ЗЗООО дильтон, что свидетельствует о чистоте полученного препарата ПСА. Аналогичным образом фракции с ПСА-активностьюобьединяюти концентрируют как обычнодообьема сО мл.Результаты очистки ПКФ и ПСА приведены в табл.1. 35Активность кислой фосфатазы на каждой стадии и удельная активность кислойфосфатазы в исходном сырье и после каждой стадии очистки приведены в табл,2,Таким образом, в результате очистки 40удельная активность ПКФ увеличиваетсядо 800 Е/мг. Способ определения содержания специфического антигена является полуколичественным с чувствительностью 10 мкг/мл и определение проводится по преципитации с соответствующей антисывороткой (по сравнению с контрольной тест-системой антиген-антитело различных разведений),Использование изобретения позволяет из одной пробы сырья получить сразу два инградиента ПКФ и ПСА, что значительно сокращает расход сырья, реактивов, а это делает способ очень экономичным, При этом сокращается время на получение инградиентов, Сначала идет очистка всей про- . бы, а после разделения на две фракции, их очистку можно вести параллельно, кроме того, стадии очистки другие и количество их сокращено, Способ проще по сравнению с известными. и эффективнее,Формула изобретения Способ получения простатической кислой фосфатазы, включающий получение эякулята, выделение из него спермоплазмы, фракционирование на фенилсефарозе и последующую хроматографическую очистку полученных фракций, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью расширения технологиче- ских возможностей способа путем одновременного выделения специфического простатического антигена, после фракционирования на фенилсефарозе выделяют две фракции, содержащие простатическую кислую фосфатазу и простатический специфический антиген соответственно, и подвергают фракцию, содержащую фосфатазу, хроматографической очистке на голубой сефарозе в 0,01 М трйс-НСГбуфере, рН 7,4, и на сефадексе С, а фракцию, содержащую антиген, подвергают хроматографической очистке последовательно на сефадексах 6-150 и 6-100.1747488 Продолжение табл. 1 2 Составитель .Лазаренко Техред М.Моргентал Корректор М.Демчи Редакто этельский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 зводствен Заказ 2473 Тираж ВНИИПИ Государственного комитета и 113035, Москва, ЖПодписноезобретениям и открытиям при ГКНТ СССРРаушская наб., 4/5