Способ определения гликозилированных белков крови

(56) Авторское свидеВ 1363072, 1986. т У 10мни АН БССА.Ярошеви е м ельство СС о ст гл Фл ЛИКОЗИЛИРОеде- л3 стредел ения гликози рови осуществляют ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ П ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГВАННЫХ БЕЛКОВ КРОВИ(57) Изобретение относится к медицинеи может быть использовано для проведения биохимических анализов в клинике и эксперименте. Цель изобретеиия -повышение чувствительности и упрощение способа. Способ состоит в том,Изобретение относится к биохимиии медицине, касается количественногоопределения гликозилированных белковкрови и может быть иснольэовано припроведении биохимических анализов влабораторной медицинской практике,Цель изобретения - повышение чувствительности и упрощение способа.На чертеже изображен предлагаемыйспособ,Способ оп лированных белков к следующим образом.Готовят анализируемую белковуюпробу, в которой необходимо определить концентрацию гликозилированиыхбелков. Производят отделение белковот избытков сахара и других низкомо"лекулярных соединений методом гельчто в анализируемой пробе проводя отделение белков от избытка ниэк молекулярных соединений, белковую фракцию разводят в 0,05 М Ва-фосф ном буфере, рН 6,8, до конечной к центрации 10- 10 М. Пробу по довательно обрабатывают перйодато калия, пиридоксамином и боргидрид натрия при молярном соотношении б ка и химических реагентов соответ венно 1:100: 100:1000. Содержание козилированных белков определяют ориметрически при длине волны Флу оресценции 390-410 нм и длине вол возбуждающего света 325-335 нм. П лагаемый способ прост (время опр ления 2-3 ч) обладает высокой чув вительностью. 1 ил. фильтрации на колонке с сефадексомС - 25, Собранную белковую Фракциюразбавляют 0,05 М Иа-Фосфатным буфером, рН 6,8, до конечной концентрации10- 10 з М. Концентрацию белкаопределяют спектрофотометрически. Кбелковой пробе добавляют 100-кратныйизбыток перйодата калия (КЛО) дляокисления углеводных остатков и вы"держивают 20 - 30 мин. При окисленииглюкозы, связанной с белком, образуется остаток глюкозы, содержащийальдегидную группу. Затем добавляют100-кратный молярный иэбьггок пиридоксамина НС 1, который формирует с альдегидной группой остатка глюкозы, основание Шиффа. Через 13 - 17 минпосле формирования основания Шиффадобавляют 1000-кратный избьггок бор 1465766гидрида натрия аа ия (МаВН ) в результате; П р и м е р 1. Сывороточный альбучего происходит восстановление не- мин человека фирмы "Кеапа 1" (ВНР)стабильного аддукта (основания Шиф- концентрацией 10М инкубируют в теФа), приводящееф ), к ковалентному связы- чение 5 сут при 37 С в водном раствоБ-ванию пири окю пиридоксамина с белком через ре Д-глюкозы концентрацией 10 М.остаток глюкозы. После инкубацин отбирают аликвоты вЧ 1 - 2 ч производят отделе- количестве 1 мл и на колонке с сефаерезние избытка пиридоксамина НС 1 и дру- дексом С - 25 производят отделениегих низкомолекулярных соединений од свободной и лабильносвязанной глюконим из известных методов отделения зы, Собранную белковую фракцию раэсахаров от белков (гельфильтрация бавляют 0,05 Иа-фосфатным буфером,диализ осаждение ТХУ и т.д,). Соби" рН 6,8, до конечной концентрации 10 э,Ф-4рают белковую пробу и измеряют интен и 10 М. Концентрацию белка оп, сивности флуоресценции на длине вол ределяют спектрофотометрически, учи ны 390 - 410 нм при длине волны воз- тывая, что 017."ный раствор сывороающего света точного альбумина человека имеет опуждающего света" 4Концентрация пиридоксамина, кова- тическую плотность 05. при 278 нм,лентно связанногонного с белком соответ- К белковой пробе последовательно дотращы глюкозы в соста бавляют 100-кратный избыток перйодатаствует концентращи глюкозыве макромолекулы при условии полного калия, выдерживают 25 мин, затем доокисления перйодатом калия углеводных бавляют 100-кратный избыток пиридокостатков и достаточно высоких концен- самина НС 1 и через 15 мин (после фортрациях пиридоксамина. мнрования основания Шиффа) добавляют2 Б избыток (2 мг) боргидрида натрия.Так как Флуоресценция пиридоксами- Через 1,5 ч производят отдепение иззна свободного и связанного с белком, бытка пиридоксамина Нь 1 и.другихьнсущественно не различается, то для низкомолекулярных соединении на коопредепения концентрации глюкозы, лонке с сефадексом С - 25. Собираютсвязанной с белком, строят калибро- З 0 белковую пробу в концентрации 1 - 2"вочный график зависимости интенсив- х 10 М. Измеряют интенсивность флуности флуоресценции свободного пири- оресценции на максимуме - 400 нм нридоксамина от его концентрации. длине волны возбуждающего света 330 нм.По оси абсцисс откладывают коли- Искомую концентрацию гликозилирован,чественные значения свободного пири- ного белка в пробе определяют по каЗБдоксамина НС 1 в молях, а по оси орди- либровочному графику через интенсивнат - значения интенсивности. Флуорес- ность флуоресценции.ценции свободного пиридоксамина НС 1,П р и м е р 2, Плазму больных саизмеренные на спектрофлкориметре харным диабетом получают иэ цельнойАшдпсо - Вопшип (США) в относитель- крови центрифугированием приных единицах. При этом используют 3000 об/мин. Для отделения избыткадлину возбуждающего света 330 нм, а сахара и других ниэкомолекулярныхрегистрацию ведут на максимуме флу- соединении плазму в колв количестве 0 4 млоресценции - 400 нм. Учитывая, что . наносят на колонку с сефадексом С -25.квантовый выход Флуоресценции свобод- Собранную белковую фракцию разбавляютного пиридоксамина практически соот Ба-фосфатным буфер , р45.ветствует квантовому выходу флуорес- до конечной концентрациин; и 1-2 10-М.ценции пиридоксамина, кбвалентно свя- Концентрацию плазмы определяют спектзанного с белком через остаток саха- рофотометрически, считая что .1 мгра измеряют интенсивность флуорес- плазмы человека в 1 мл Иа-Фосфатного.ценции белковой пробы и по калибра- буфера, рН 6,8, имеет оптическуювочному графику через интенсивность плотность 0,.69 при 278 нм.8 нм. К плазмефлуоресценции определяют по осиабсцисс концентрацию пиридоксамина,ковалентно связанного с белком через до авляют 100-кратный м робавляют 00-к атный молярный избы,оотаток сахара. Определенная таким ток пиридоксамина НС 1ток пи оксамина НС 1 и через 15 минобразом концентрация пиридоксамина .(после формирования основания Шиффа)соответствует искомой концентрации добавляют 2 мг (100-кратный избыток)гликоэилированного белка. боргидрида натрия, Через 1,5 ч проиэ5 14657водят отделение избытка пиридоксамина НС 1 и других низкомолекулярныхсоединений на колонке с сефадексомС - 25, Собирают белковую фракцию в5концентрации 1-210М и измеряют интенсивность флуоресценции ( М р, == 400 нм, Л= 330 нм). Искомуюконцентрацию гликознлированных белковв пробе определяют по калибровочномуграфику через интенсивность флуоресценции.При постановке опыта (пример 2) одновременно сравнивают количество гликозилированных белков плазмы, опредебляемых с помощью пиридоксамина убольных сахарным диабетом, с уровнемсвободного сахара в плазме кровибольных (см. чертеж).Для этого строят график, где полевой оси ординат откладывают концентрацию свободного сахара в плазмебольных в ммоль/л, по правой оси ординат - интенсивность флуоресценциипиридоксамина, связанного с белкамиплазмы, в относительных единицах приЛь, = 330 нм и Л = 400 нм, Наоси абсцисс обозначены порядковыеномера больных, взятых для обследования (всего 19 больных),Точками показаны значения концентрации свободного сахара в плазме,знаком "о" - интенсивность флуорес- .денции. Уровень сахарав плазме больных определяют О-толуидиновым мето,дом. С увеличением количества каваЗБлеитно связанной с белками плазмыглюкозы и, соответственно, количеством связавшегося с ней пнридоксамива,возрастает интенсивность ФлуоресценцииеПредлагаемый способ по сравнеюю .с известным новьппает чувствительность"определения более, чем на 2 порядказа счет использования в качестве ре 4агентов для обработки белков в пригатовденной анализируемой пробе перйо 66 6дата, пиридоксамина и боргидрида натрия с последующим графическим определением количества гликозилированных белков в пробе по интенсивности Флуоресценции на длине волны 390- 410 нм при длине возбуждающего света 325 - 335 нм.Упрощение определения при осуществлении предлагаемого способа обеспечивается тем, что известный способ предусматривает приготовление анализируемой пробы, отделение белков от сахаров, обработку их щавелевой кислотой, кипячение в течение 24 ч, охлаждение белков трихлоруксусной кислотой, добавление к надосадочной жидкости тиобарбитуровой кислоты и спектрофотометрирование, в то время как предлагаемый способ облегчает определение за счет устранения ряда операций - кипячения, охлаждения белков, что позволяет уменьшить время определения до 2 - 3 ч при исследовании каждой пробы по сравнению с 26 - 30 ч при использовании способа-прототипа определении гликозилированных белков,Формула изобретенияСпособ определения гликозилированных белков крови, включающий приготовление анализируемой пробы и отделение белков от сахаров с последующей обработкой их химическими реагентами и количественной оценкой, о т л и ч а ющ и й с я тем; что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа,пробу белка берут в концентрации 10 10М, обрабатывают последовательно перйодатом, пиридоксамином и боргидридом натрия при малярном соотношении белок пробы: химические реагенты со" ответственно 1:00; 100 ф 1000, а количество гликозилированных белков определяют Флуориметрически на длине волны флуоресценции 390 - 410 нм, при длине возбуждающего света 325 - 335 им.465766 О ОСоставитель Н, Гуляевактор И. Касарда Техред Л.Олийнык Коррек Корол Заказ 938/44 Тираж 788 ВНИИПИ Государственного комитета по иэоб 113035,;Москва, Ж, РаПодписноенияи и открытиям при ГКНТ С ая наб д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул. Гагарина,0 Ь ф Ъ Ъ Ю б 0 срйисыд няер йпьногс