Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ ;г -, - РЕСГ 1 УБЛИК(51)5 6 01 И 33/68 ТВЕННЫЙ КОМИТЕТБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМНТ СССР ГОС ДАРСПО ЗОГРИ ГН О ИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(57) не,с ф а овния соба скор роль орди абсц свер няяЦ лени осущ опти и 4418261/30-1429.02,8823. 11.90, Бкцт. У 43Минский государственный медиий институтЛ.А.Бизюк612.015 (088,8) Авторское свидетельство СССР9024, кл. С 01 И 39/68, 1986. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ РОМБИНА 111 В ПЛАЗМЕ КРОВИ Изобретение относится к медициименно к способам определения обретение относится к медицине ается определения активности осго ингибитора системы свертыварови антитромбина 111.ь изобретения - ускорение спофигФ 1-2 представлены кривые сти инактивации тромбина контого и опытного образцов по оси ат значения 18 С , а на оси сс С,соответственно время ыванйя фибриногена в пробах и инкубации проб (на фиг.2 верхривая - по предлагаемому, нижпо известным способам).ь достигается тем, что опредеактивности антитромбина 111 ствляют в реакционной среде с льными параметрами для проявлеаксимальной ингибиторной актив 2активности антитромбина 111 в плазме крови. Цель - ускорение способа. Измеряют скорости инактивации стандартного количества тромбина антитромбином 111 исследуемой плазмы, строят кривые скорости инактивации тромбина антитромбином 111 опытного и контрольного образцов плазмы, посредством сравнения которых получают искомое значение активности антитромбина 111 исследуемого образца. Исследование проводят в реакционной среде, содержащей О, 1 М натрий-фосфатного буфера и О, 15 М раствора ЮаС 1 в объемном соотношении 1:1, рН 8,0-8,2. 2 ил. ности антитромбина 111 исследуемой плазмы крови, Для этого исходные компоненты реакционной смеси - тромбин и исследуемую плазму разводят до стандартных концентраций О, 15 М раствора ИаС 1, с рН 8,0-8,2. При ионной силе раствора ВаС 1 =О, 1 и 0,2, активности антитромбина 111 44 и 217 соответственно,При использовании данной реакционной среды создаются условия для увеличения на 25-30 Х скорости реакции тромбин/антитромбин 111 исследуемой плазмы, что приводит к уменьшению времени определения активности антитромбина, 111 на 25-307. по сравнению с известным способом. Способ осуществляют следующим образом, 1608585Для осуществления способа используют следующие реагенты;реакционная среда: 1 об.ч. О, 1 Мнатрийфосфатного буфера с рН 8,0-8,2(готовят смешиванием 95,0 мл 0,2 Мраствора ИаНРО,) и 5,0 мл 0,2 М раствора ИаНРО, проверяют и корректируют рН в пределах 8,0-8,2 на ионометре, затем доводят дистиллированной 1 Оводой до 200,0 мл) и 1 об.ч. 0,15 Мраствора ИаС 1;.,О, 15.И раствор ИаС 1;тромбин 20 ед. ВхН/мп в растворе реакционной среды.Предварительно заготовленный ряствор тромбина активностью 100 ед,ИН/мп хранят в силиконированных флаконах при температуре -20 С, передупотреблением разводят в 5 раз реакционной средой до требуемой активности; фибриноген 8-10 г/л раствор вО, 15 М ИаС 1 (достаточно до 5 мл) готовят перед исследованием; плазмакрови (опытная и контрольная), Получают по обычной методике бестромбоцитарную плазму из веноэной крови, стабилизированной 38 г/л тринатрийцитратом в соотношении 9:1. Контрольная плазма, это пул плазм от 8-10доноров. Сохраняется небольшими объемами (до 1,0 мл) во флаконах притемпературе -20 ОС в течениегодабез потери активности антитромбина111Перед употреблением контрольнуюи опытную плазмы разводят реакционнойсредой в 10 раз (к 0,45 мл реакционной среды добавляют 0,05 мл плазмы),получая 107.-ные растворы контрольнойи опытной плазм, Для каждой исследуе мой плазмы готовят по 4 стеклянныепробирки с 0,1 мл раствора фибриногена и помещают в водяную баню при температуре 37 С,Приготовленные пробирки с реагентами и раствор тромбина перед исследованием прогревают до этой температуры.Манипуляции, проводимые с контрольным и опытным образцами плазмы,являются идентичными: в пробирку с0,5 мп исследуемой плазмы добавляют0,5 мл раствора тромбина, Смесьвстряхивают для получения малообъемного сгустка фибрина, фибриновыйсгусток отжимают и сразу удаляют изреакционной смеси. На 4,6,8 и 10 мининкубации И) берут по О, 1 мп смесии добавляют в пробирки с О, 1 мл раствора фибриногена, Секундомером регистрируют время свертывания (й) фиб.риногена остаточным тромбином смеси.Отбор проб смеси можно делать ипри других значениях Сщ, увеличитьили уменьшить кратность забора. Одна"ко забор проб не должен быть больше10 мин, инкубации смеси, так как резко возрастает значение С, а затемнарушается линейность хода реакциипосле 14-15 мин инкубации.Вычисление. Из полученных в секундах значений с на 4,6,8 и 10 мининкубации смеси, извлекают десятичныйлогарифм и получают соответствующиезначения 18 С . Кривые скорости инактивации тромбина антитромбином 111контрольного и опытного образцовплазмы строят на миллиметровой бумаге в координатах: значения 1 я С наоси ординат, кна оси абсцисс.Обычно построейные кривые не имеютобщего значения 1 я с при нулевомзначении щ. При расчете необходимосовместить начальные точки кривыхс соблюдением угла их наклона (фиг. 1),считают, что любая выбранная точкана кривой скорости ннактивации тромбина антитрамбинам 111 контрольногообразца соответствует 10 ОХ активности антитромбина 111 (такая точкавзята на 10 мин инкубации смеси).К ней соотносят точки вновь получен"ных кривых для опытных образцов (приодинаковом значении С),) и такимобразом получают искомое значениеактивности антитромбина 111 опытныхобразцов,Пределы нормальных колебаний активности антитромбина П 1, определенные для донорской группы (19 человек), составляют 84-1163, 100 + 2,0 Х (Х+ш). Коэффициент вариации ддя данного метода не превышает 17Приме р 1, У пациента 1, исследуя активность антитромбина П 1 плазмы крови предлагаемым способом в динамике (й,=4,6,8 и 10 мин), получили значейия й. =45,5; 71) 112 и 182 с и соответственные значения 1 цС =1658, 1,851; 2,049 и 2,260. Для построения калибровочной кривой исследовали контрольную плазму при тех же значениях ;щ, подучили, что С =41,5; 63; 96,5, 148 с и соответственные значения 1 С =1,618;1,799; 1,9"., 2, 170.1608585 6 смоделированной кривой (П), найдено значение активности антитромбина ЕЕЕ для пациента 2, равное 797., что нюке нормы. Способ определения активностиантитромбина ЕЕЕ в плазме крови путемсмешивания исследуемой и контрольнойплазм с раствором тромбина с после дующей регистрацией скорости инактивации тромбина в пробах в динамикеи их сравнения, о т л и ч а ю щи йс я тем, что, с целью ускоренияспособа, регистрацию проводят в средеинкубации, содержащей О, 1 И натрийфосфатный буфер с рН 8,0-8,2 и 015 Мраствор хлористого натрия в объемномсоотношении 1;1. По полученным значениям 18 Сроят (фиг.1) кривые для контрольго образца плазмы (к) и для иссле емого образца плазмы пациента 1 1), При соотношении точек на 10 мин кубации для кривых опытного (П ) контрольного (к) образцов плазмы йдено, что значение активности антиомбина ЕЕЕ у пациента 1 равно 10 03, - это в пределах нормы.П р и м е р 2. При исследовании обы плазмы крови у пациента 2 в димике (й=4; 6, 8 и 10 мин) получи- значения й =29,5; 39,8, 56,5; 79 15 соответственно им значения 18 й, = ,460, 1,600, 1, 752 и 1,898. Постенная по полученным значениям 18 й ивая скорости инактивации тромбина титромбином ЕЕЕ образца плазмы паента 2 (П) не имеет общего: значея Ей с калибровочной при нулевом . ачении Сия. Для получения возможсти их сравнения моделируют новую ивую (на фиг.1 обозначена крупным рихом).для пациента 2. Путем соотшения точек, взятых на 10 мин инкуции на калибровочной (к) и вновь На фиг,2 верхняя кривая относится к предлагаемому, нюкняя - к известному способам. 1003 активность (точка В) по известному способу достигнута только через 4,5 мин, по отношению к предлагаемому способу (точка А). Формула изобретения1 б 08585 Составитель А.АгурееРедактор С.Патрушева Техред М,Дидык Корректор А.Осауленко и ГКНТ СССР производственно-иэдательскид комбинат Патент г. Ужгороду ул. Гагарина 10 ЗакаВНИИПИ Зб 14 Тираж 507 Подписное Государственного комитета по иэобретениям и открытия 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/