Способ определения активности антитромбина-вм

(54) СПОСОБ ОП АНТИТРОМБИНА- (57) Изобрете не, а именно активности ан ную плазму ра ЛЕНИЯ АКТИВНОСТ Мние относитс к способу оп титромбина-В збавляют 0,9 к медициделения Цитрат-ным растГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР пО делАм изОБРетений и ОткРыт 15.11.86, Бюл. 9 42Берингер Маннхайм ГМБХ (БЕ)Хельмут Лилль, Врген Шренктер Вундервальд (ЭЕ)612.115.12:612.0151(088.8)Патент ФРГ 30 38 163,С 07 0 7/00, опублик. 06.05.8 вором БаС 1. Готовят антитромбинную (АТ) реакционную смесь, В пластмассо вые кюветы вносятся растворы АТ-реак ционной смеси и 0,97-ного БаС 1 в одом случае и разбавленная плазма и АТ-реакционная смесь в другом случа Эти смеси инкубируют в течение 5 ми и смешивают с 1,9 ммоль хромозима Т В течение 30 с определяют начальную экстинкцию. Через 30, 60 и 90 с пов торяют измерение. Из разницы между коэффициентами экстинкции определяю среднее значение. Таким образом, по лучают общую антитромбинную активность, При повторении измерения с пониженной концентрацией гепарина получают АТ. Из разницы между общей антитромбинной активностью и АТполучают количество антитромбина-ВМ, 5 табл. 1 ил.Изобретение относится к способуопределения активности нового ингибитора тромбина, который называетсяантитромбином-ВМ (АТ-ВМ),Определение АТ-ВМ основано на 5использовании различия в специфичности по отношению к АТв случае различных кофакторов. К испытуемому раствору добавляют кофакторантитромбина - ВМ, тромбин и апре- О,деляемый субстрат тромбина и по количеству продуктов расщепления субстрата тромбина судят об активностиантитромбина-ВМ.П р и м е р 1, 9 ч. свежеотобранной крови смешивают с 1 ч,0,11 моль/л цитрата натрия и центрифугируют при 3000 об./мин. 20 Фл полученной цитратной плазмы разбавляют 1,0 мл 0,9".ного раствора Мв,С 1. 205 мл раствора, содержащего0,1 М трис/НС 1, рН = 8,1 0,15 МИаС 1, 0,01 М ЭДТА, 1 . полиэтиленгликоля, 6,5 10 апротинин/мл и 1,75 БРгепарина/мл, смешивают с 0,25 мл ра-5створа тромбина с 0,5 ед/мл и оставляют стоять в течение 30 мин (АТреакционная смесь).Проводят определение по следующейсхеме при 25 С в кювете с толщинойслоя 1 см и при длине волны Нр 405 нм.Измеряется прирост экстинкции посравнению с воздухом. В одну пластмассовую кювету вносят пипеткой0,10 мл 0,9%-ного ИаС 1 и 2 мл АТ-ре-, 35акционной смеси, а в другую - 0,10 млразбавленной плазмы и 2 мл АТ-реакционной смеси; смешивают и инкубируютв течение 5 мин при 25 С. Затем содержимое каждой кюветы смешивают с 4 О1,9 ммоль хромозима ТН - таз-гли-проагд-рИА .(0,20 мл), в течение 30 с определяют начальную экстинкцию и одновременно включают секундомер. Через30, 60 и 90 с повторяют определение. 45Из разницы между коэффициентами экстинкции (Е/30 с) определяют среднеезначение.Таким образом, получают общую антитромбинную активность. 5 ОПутем повторения измерения с псниженной до 0,2 1 Б Р/мл концентрацией гепарина получают концентраврпоАТ. Из разницы между общей антитромбинной активностью и АТполучают количество АТ-ВМ,П р и м е р 2. Используют следующие растворы реагентов. 1, Буфер;, трис/НГ 100 ммоль/л,рН = 8,1; декстрансульфат (м,в.500 000) 1 мл/100 мл; апротинин 6,5111/мл (единица ингибитора; трипсин,хромозин ТН 25 С; ИаС 150 ммоль/л.2. Тромбин 0,5 ед/мл,3. Хромозим ТН (тоз-гли-про-агрИА) 1,9 ммоль/л,4. Смесь реагентов: трис/НС 190 ммоль/л, рН=8,1; декстрансульфат0,9 мг/100 мл; апротинин 5,9 1 Н/мл,БаС 1 136 смоль/л; тромбин0,045 ед/мл,Приготовление смеси реагентов,Смешивают в пластмассовой емкостии оставляют стоять примерно в течение30 минут при 25 С 10 мл буфера (раствор 1) и 1 мл тромбина (раствор 2).Подготовка пробы.Для определения 1 ч, цитратнойплазмы разбавляют 200 ч 0,9 -ногоИаС 1 (например,50 мл плазмы и 10 мл0,9%-ного раствора ИаС 1).Условия определения: длина волныНд 405 нм; пластмассовая кювета, толшина слоя 1 см; температура измерения 25 С.Измерение по сравнению с воздухом(прирост экстинкции).Для каждой серии измерений требуется по меньшей мере одно холостоезначение с тромбином (ТЬ), В одну пластмассовую кювету вносят пипеткой0,05 мл 0,9/-ного 11 аС 1 и 1 мл раствора 4, в другую - 0,05 мл разбавленной плазмы и 1 мл раствора 4, смешивают, инкубируют в течение 5 минпри 25 С, Затем содержимое каждойкюветы смешивают с раствором 3 (ТЬ0,1 мл проба:= 0,1 мл) и рассчитывают АЕ/30 с;Е р /30 с - Ь Ер 0 Бы/30 с=/30 с х 951,1Для определения готовят растворыАТ(концентрация 12,5 1 Юмл при25 С) и АТ-ВМ (концентрация 12,1111/мл при 25 С).Эта концентрация соответствуетнормальному содержанию АТв человеческой плазме.Для того, чтобы показать специфичность определения в присутствии АТАТ, определение проводят как сраствором АТ-ВМ, так и со смесью обоих растворов.Измерение АТ-ВМ1 ч. раствора АТ-ВМ разбавляют100 ч. физиологического раствора(Н-Р-рЬе-рхр-агц-рИА) веде 12,04 12,11 ИаС 3 0,05 мл пробы + 5,0 мл раствора ЕаС 1).Из этого раствора готовят дальнейшие разбавления с физиологическим раствором поваренной соли (9 ч. ра створа АТ-ВМ + 1 ч. раствора 11 аС 1;8 + 2; 7 + 3 и т.д. вплоть до конеч ного разбавления 1:1000),Постоянные объемы (0,05. мл) приготовленных разбавлений АТ-ВМ затем используют в тесте, согласно которому измеряют внутри выбранных пределов пропорциональные величины подавления ЬЕ , (см. чертеж).Измерение АТ-ВМ в присутствии 15 АТ.0,05 мл раствора АТ-ВМ разбавляют 0,05 мл раствора АТи 4,95 млфизиологического раствора повареннойсоли (соответственно 1 ф 100 разбавление обоих компонентов).Иэ полученного раствора готовятсерию разбавлений аналогично описанному выше.Постоянные объемы (0,05 мл) приготовленных разбавлений затем используют в тесте (см. чертеж).Как видно из данных, приведенныхна чертеже, наличие АТне влияетна результат измерений, измеряется 30только АТ-ВМ,Аналогичные результаты получаютпри использовании декстрансульфата,сложных эфиров мукополисахарида сполисерной кислотой, пентозанполи".сульфатов или короткоцепочечных про"язводных гепарина.П р и м е р 3. Влияние концентрации тромбина ка определение АТ.В качестве пробы применяли водный 40раствор АТ. Применяли реактив попримеру 1: трис-буфер, рН 8,11,75 УБ Р/мл; субстратоль/л.Результаты опред я при 5 4П р и м е р 4. Влияние концентрации тромбина на определение АТ-ВМ с с гепарином.В качестве пробы приняли водный раствор антитромбина-ВМ. Применяли реактив по примеру 1: трис-буфер, рН 8,1; гепарин 1,75 УБ Р/мл; субсз рат 0,19 ммоль/л.Результаты определения приведены в табл. 2. П р и м е р 5. Влияние концентрации тромбина на определение АТ-ВМ с декстрансульфатом.В качестве пробы применяли водный раствор антитромбина-ВМ. Применяли реактив по примеру 1: трис-буфер, рН 8,1; декстрансульфат, 1 О мкг/мл; субстрат, 0,10 ммоль/л.Результаты определения иы в табл. 3.1271379 Таблица 4 Определение АТ-ВМ,1 Б/мл, в присутствиидекстрансульфата,юг/мл Субстрат Хромозим ТЯ 2238,43 5,29 3 Зависимость акот концентрации субс рата-хромо зима ТНтоэ-глипро -рВА,)К-значение 2 х 10 моль/л. мер тромб вност 5 абли 0,152 0 0,038 0 123 0,144 0,156 0,15 7 0,155- коэффициент экстинкции и-нитроанилина 9, 70 см 35,Ч - объем пробы тромбина (АТ-ракционная смесь 2,00 мл);2 - фактор необходимый для того, чбы получить йЕ/мин. гналТ-реромбиполучали с и 0 с то в центрация ед/мл. При примененно ), концент ановится р аль в теци но ратаая о 6 Препарат гепарин количеством УЯР-еди мер, концентрация г БЯР/мл в буферном р центрацию 0,95 БЯР/ ной смеси (а именно го раствора смешиваю вора тромбина), Тог вается концентрация УЯР/мл, так как в т ную смесь разбавляю ге-. сте. бина а кте1 мл ется алри и змес),кон иой 5,0т с ноастазы 3) е приме (2,30 сте объе нмл) Работу осуществляли с реактивомдо примеру 1 (определение исходногзначения тромбина в соответствии сукаэанным примером). Концентрациятромбина в тесте составлялатромбина в тесте составляла0,015 ед/мл.Как показали экспериментальныеданные, тест можно осуществлять прконцентрациях субстрата 0,0190,28 б ммоль/л.Поскольку субстрат Я 2238 имеетдентичное К - значение 9 хМмоль/л, для этого субсттельна такая же граничн дочти их 10:действиласть.РасчпарикаОпре(ед/мл)ренногоследующ т концентраций тромбинли декстрансульфата веление концентрации тпроизводили, исходя ов тесте сигнала (аЕ/им образом:йЕ Чх 230 с бхЧ Есл тромби акцион на сос нейшем сте см тромби 0,10 е например,аЕ/0,500/ ой смеси ко авляла 0,12 разбавлении сью (2,30 мл а в тесте с8.7 6оставитель Еехред А. Крав Колмакова Корректор С.Шекмар актор Л. Веселовска 8/ Зака Подписмитетаоткрытийя наб.,Тираж 778 Государственного к по делам изобретений и 5, Москва, Ж, РаушскеСР ВНИИПИ Произ вод енно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 7 1271379 8 Декстрансульфат отвешивают в бу- Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я1 ферчый раствор (например, 1 мг/100 мл Способ определения активности анРасчет концентрации в тесте проиэво- титромбина-ВМ, з а к л ю ч а ю - дят следующим образом: для получения щ и й с я в том, что к исследуемой реакционной смеси 1 О мл буферного ра- цитратной плазме или сыворотке крови створа (раствор 1) смешивают с 1 мл добавляют 0,01-0,1 ед/мп тромбина, раствора тромбина (раствор 2); в ре,076-0,285 ммоль/л его субстрата - зультате концентрация декстрансуль- (тоз-гли-про-аг 8-рЯА или Н-В-рЬе-рхрфата в реакционной смеси (раствор 4), -аг-р 11 А) в буфере с рН 8, и)вб еес Н 81 истановится равной 0,909 мг/100 мл. 1 О 25 мг/мл декстрансульфата или корот- ,В тесте реакционная смесь раэбавля- коцепочечных производных гепарина и ется от 1,0 до 1,15 мп. Таким обра- по количеству образующихся продуктов зом, концентрация декстрансульфата в расщепления субстрата тромбина судят ,тесте составляет 0,79 мг/100 мл, или о величине активности антитромбина,9 мкг/мл. ВМ.АТ-ВМ