Способ определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови

СООЭ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕОЪ БЛИН 01 Ы 33/68 51) 5 ИТЕТРЫТИЯМ РЕТ азобнеатричес В.Ситкевич,тини ТВ,Дмитр о,1975, Ю 1 1,ИЯ АКТИВНОСТИВ ПЛАЗМЕ КРОВИсится к медицине,м определенияв трипсина в я к области спользовано ости ингиби ферментов в при различ ие относитожет бытьания активлитицескихх жидкостяниях,брет ны и медиц для и торов биоло следов протео ицески болева ых з ние то овь азмы.П.р и вой же нозная 1. У практически 4 лет натощак вз в количестве 9,0 ержащую 1,0 мл 3 итрата натрия. П мер нщины кровь ку, со твора а Р в зма в проби ного ра ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОПРИ ГННТ СССР(71) Ленинградский имедицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕИНГИБИТОРОВ ТРИПСИНА(57) Изобретение отнв частности к способактивности ингибитор Цель изобретения - и ше ц ности способа.Из исследуемой биологической жид кости готовят два разведения ь 10 и в 30 раз, в каждом из них определяют антиферментную активность и расциты вают активности ингибиторов, соответствующую неразведенному образцу.801573439 А 2плазме крови, Определение активности ингибиторов трипсина проводят в при- сутствии фермента, субстрата и пл мы, разведенной в 10 и 30 раз, а истинной активности ингибиторов в разведенной биологической жидкости судят по формуле Х = К(А-А,+А,С- -АС,):(С 2-С,), где Х - активность ингибиторов протеолитицеского фермента; С, - минимальное разведение; С - максимальное разведение; А, - с;епень .торможения протеолиза при минимальном разведении; А- степень торможения протеолиза при максимальном разведении; К - коэффициент пропорциональности. получена путем центрифугирования этой пробирки при 3000 об/мин в течение 1 О мин (известные условия, используемые в биохимических исследованиях), Плазму разводили в 10 и в 30 раз 0,05 М трис-НС 1 буфером с рН 8,02, содержащим 4 .10-3 М хлорида кальция (буфер, используемый для оп ределения активности трипсина и его ингибиторов в известных способах). Для этого в две пробирки наливалипо 0,1 мл плазмы, по 0,9 мл (дляразведения в 10 раз) и 2,9 мл (дляразведения в 30 раз) буфера. Из каждой пробирки отбирали по 0,2 мл раствора соответственно разведенной плазмы и вносили в две пробирки, содержащие по 0,2 мл раствора трипсинамкг/мл, приготовленного на томже буфере, и 0,6 мл буфера. Все про1573430 Е(1 - )Вь в 30 бирки инкубировали 10 мин при 20 С,затем добавляли 1,0 мл раствора казеина по Гаммарстену, приготовленного на том же буфере, и инкубировали 20 мин при 37 С, В пробирки добавляли 3,0 мл 5-ного раствора трихлоруксусной кислоты, Фильтровали через бумажный фильтр "синяя лента" и определяли оптическую плотность против контроля, 1 О в который вместо трипсина добавляли 0,2 мл буфера, а трипсин вносили после остановки реакции (после добавления трихлоруксусной кислоты) на спектрофотометре Сфпри 280 нм в кю. вете 1 см.Отдельно ставили пробу на активность фермента (контроль): в пробирку наливали 0,2 мл раствора трипсина 74 мкг/мл, 0,8 мл буфера и 1,0 мл 20 1-ного раствора казеина. Инкубировали 20 мин при 37 С, добавляли 3,0 мл 53-ной трихлоруксусной кислоты, фильтровали через бумажный фильтр нсиняя лента" и определяли оптическую плот ность против дистиллированной воды.Степень торможения протеолиза при различных .разведениях определяли по формуле: где Е - количество фермента в пробе;В - количество гидролизованногоосубстрата в присутствии исследуемого образца (соответствует приросту оптическойплотности в условиях опыта);В- количество гидролизованного 40субстрата без исследуемогообразца (соответствует приросту оптической плотностив пробе на контроль активности фермента);45С - разведение;Ч - объем исследуемого образца(разведенного) в пробе,При разведении в 10 раз А = 682,При разведении в 30 раз Аг = 1252,Истинную активность ингибиторовтрипсина в неразведенной плазме расчитывали по формуле Аг- А, + АгС - АС,х=к 1С где Х - истинная активность ингибиторов протеолитического фермента е неразведенном образ-,це биологической жидкости;- минимальное разведение (в1 О раз);С - максимальное разведение (в30 раз);А - степень торможения,протеолиза при минимальном разведении;А г - степень торможения протеолиза при максимальном разведении;К - коэффициент пропорциональности, зависящий от характеристик используемого фермента и субстрата (в данномслучае К 0 1): Х = 1= 423 мкг трипсина/мл,П р и м е р 2. Определение проводилось также как и в примере 1, заисключением того, что плазму разводили 10-150 раз. При разведениях больше 30 наруша - ется линейность зависимости степени торможения протеолиза от разведения. Это делает невозможным использование больших разведений, так как представленная формула для расчета позволяет определить активность ингибиторов в неразведенной биологической жидкости по результатам степени торможения протеолиза при различных разведениях только при наличии линейной зависимости степени торможения протеолиза от разведенияФормула изобретения Способ определения активности ингибиторов трипсина в плазме крови путем проведения протеолиза в присутствии разведенной плазмы с последующим спектрофотометрическим измерением степени торможения протеолиза субстрата, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа плазму разводят минимально в 10 и максимально в 30 раэ, в каждом разведении определяют степень торможения протеолиза субстрата,а активность ингибиторов трипсина в нераз" веденной плазме определяют по формуле ГАг.- А, + АСг - АгС где Х - активность ингибиторов протеолитического фермента;1573430 Составитель Л.СабуроваРедактор Н,Яцола Техред Л.Сердюкова Корректор М,Куцерявая Заказ 1642 Тираж 513 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул . Гагарина, 101 С 1 - минимальное разведение; С - максимальное разведение; А - степень торможения протеолиза при минимальном разведении;Д- степень торможения протеолиза при максимальном раз ведении;К - коэффициент пропорциональности, зависящий от характеристик используемых фермента и субстрата,