Способ определения антител к лептоспирам

союз советскихСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 33/5 НТНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) И ИЕ ИЗОБР ПИС СВИДЕТЕЛЬСТВ К АВТ(57) Использован мия, серологическ инфекционных заб бретения: в качес комплекс стафило имунной ле югированнь о-исследоваитут и Цент- вательский(71) Среднсазиатский научтельский противочумный инсральный научно-исслединститут эпидемиологии.(56) Лаб, дело, - 1987. )ч. 4, с. Изобретение относится к медицине, в частности, к серологической диагностике инфекционных болезней.Цель изобретения - повышение чувствительности иммуноферментного метода при определении лептоспирозных антител,Укаэанная цель достигается тем, что гипериммунная лептоспирозная сыворотка предварительно адсорбируется на взвесь инактивированных клеток стафилококка штамма Кован 1 и весь комплекс метится ферментом каталазой,Заявляемый способ отличается от прототипа сочетанием новых условий: использование взвести стафилококка для ориентации антител к лептоспирам и мечение комплекса стафилакокк-антитела к лептоспирам ферментом каталазой,Эти особенности позволяют улучшить условия связывания антител с антигеном на планшете. что повышает чувствительность метода, повысить содержание каталазы на комплексе, что также повышает чувствительность метода. проводить определение антител к лептоспирам в сыворотках, независимо от их видового происхождения. ЯХ 1820325 А 1(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛЛЕПТОСПИРАМ кие; медицинская биохиие способы диагностики олеваний. Сущность изотве антигена используют кокка Кован 1, с гиперрозной сывороткой, коньапазой, 1 табл,При изучении патентной литературы по постановке иммуноферментного метода Я при определении антител к лептоспирам сходных признаков по существу заявляемого способа авторами не обнаружено. СП р и м е р . Приготовление коньюгата по предлагаемому способу. К 1 мл 20 млрд Б взвеси инактивированного прогреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин стафилококка.штамма Кован 1 добавляют 1 мп лептоспирозной сыворотки в разведении 1:20. Смесь перемешивают и выдерживают в течение 60 мин при 40 С после чего триж- Са ды отмывают 0,9-ным раствором хлорида (,А) натрия путем центрифугирования при 3000 с) об/мин в течение 10 мин. Осадок нагружен- (Л ного антителами стафилококка ресуспендируют до 1 мл и добавляют каталазу в обьеме .3 ф 1 мл из расчета 5 мг/мл, перемешивают и ф вносят 0,1 мл 1-ного водного раствора глутарового альдегида, Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 3 ч и трижды отмывают 0,9-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05 О/р твина. Осадок суспендируют в 5 мл 0,9 оз раствора хлорида натрия. содержащего 0,05 твина.10 15 20 30 40 45 50 Для мечения комплекса стафилококкантитела к лептоспирам нами использована каталаза, производства США Са 1 Ьоспегл активностью 8512 1 О/щц. Параллельно готовили коньюгаты пероксидэзы хрена с натиглобулинооыми сыворотками (Горьковский НИИЭМ) по известному способу и кроме того, использовали коммерческую тест-систему (Стаоропольский НПО "Аллерген" ) для определенияантител к лептоспирам,На планшеты Ленинградского завода полимероо наносили лептоспироэный родо- специфический антиген о дозе 10 мкг /мл,Планшеты выдерживали не менее 24 ч при комнатной температуре и трижды промывали 0,9 о-ным раствором хлоридэ натрия, содержащего 0,050 таина. Кроме того, применяли планшеты. сенсибилизированные лептоспироэным родоспецифическим антигеном, производства НПО "Аллерген",Рабочие разведения полученных коньюгатов определяли путем прямой постановки ИФА (планшет с адсорбированным антитегном + коньюгат в разведениях от 1:50 до 1:3200). Результат ИФА регистрировали визуально,При постановке основных опытов напланшеты с адсорбирооанным антигеном наслаивали гомологические и гетерологические сыворотки от больных с диагнозом лептоспироз, шигеллез, эшерихиоэ, подтвержденными бактериологически. и гипериммунные сыворотки лептоспирозные, шигеллезные и эшерихиозные, Сыворотки наслаивали в обьеме 0,1 мл в разоеденных от 1:25 до 1:51200. После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0,9 О(,-ным раствором хлоридэ натрия, содержащего 0,057; тоина,Далее в планшеты вносили коныогаты о рабочем разведении: собственного приготовления - 1; 800, э коммерческие - согласно инструкции, прилагаемой к тест-системе. После 60 мин экспозиции планшеты трижды отмывали 0,9 О/,-ным раствором хлорида натрия, содержащего 0,05; таина. Для проявления каталазы в планшеты вносили по 0,025 мл 0,3раствора перманганата, а перед этим за 30 мин - 0,0015 ный раствор перекиси водорода. В случае присутствия каталазы происходит раэложе.ние перекиси водорода и перманганат калия не теряет своей фиолеговой окраски. В присутствии перекиси водорода перманганат калия за несколько секунд меняет цвет на ярко желтый. Проявление пероксидазы проводили хромогенной смесью. состоящей из 5-аминосалициловой кислоты и перекиси водорода. В случае присутствия пероксидазы цвет в лунках - коричневый или коричнево-розовый. При отсутствии - цвет слабо розовый или бесцветный, Проявление фермента в тест-системе проводили согласно инструкции.Сравнительная чувствительность определения антител и специфичность предлагаемого метода приведены в таблице,Сравнительная чувствительность методов показала преимущества предлагаемого способа в 2-4 раза по сравнению с известным методом определения антител к лептоспирам. Результаты реакции после внесения перманганата калия четкие, появляются через несколько секунд и сохраняются о течение нескольких дней.Специфичность предлагаемого метода проверена при внесении в планшеты с адсорбированным лептоспироэным антигеном гомологичных и гетерологичных антисывороток(таблица). Как показанб, специфичность всех изучаемых методов оказалось достаточно высокой и аналогичной,Таким образом, нами разработано новое техническое решение постановки иммуноферментного метода на основе каталээы, имунной лептоспирозной сыворотки и взвеси стафилококка штамма Кован 1, с более высокой чувствительчостью определения антител к лептоспирам.Формула изобретения Способ определения антител к лептоспирам, включающий адсорбцию антигена на твердофазном носителе, инкубацию с иммунной сывороткой и визуалиэирующим агентом. о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве антигенэ используют комплекс гипериммунной лептоспирозной сыворотки, адсорбированной на инактивированные клетки стафилококка штамма Кован и коньюгированный с каталазой".1820325 Чувствительность и специФичность методов на примере нескольких сывороток Не тол тюе400 800 1600 3200 6400 12800 25600 51200 1 2 3 4 к к кр б б Ь б б б б Известный к Предлагае"ьвьй а а а а а а Р Р а Р а Р Тестщсистема б б б 6 с с ссев е е е ве е сеевиьь аеас ещ и . севаПри разведении шмгеллеэной сыворфтки - 1/т е ы а а щ ещ е ветс25 50 100 200 400 800 1600 3200 1 2 3с е еб б б б б б б Известный б б б б Предлагаеьеьй Р Р Р Р с с . с Р с сР и Рс Тесттсистема с т е щпри разведении эшермхиоэной сыворотки 1/т 1 2 3 4е Известмьй б б б 6 б б Ь б б б 6 П редлаг ае"мый Р Р Р Р Р Р Р РТо ае на планшете ставропольского ППО "Аллерген" Р а Р при разведении лептоспнроэной сыворотки ы е 400 800 1600 3200 6400 11800 25600 51200 1 2 ива в е еа ее еа васса с в е веетб б 6 6 б б Известный к к к кр Предлагаеьвй а а а Р П т Ра Р ж и Тест-систеема б б 6 б с с при разведении шигеллеэной сыворотки 1/Т:25 50 100 200 400 800 1600 3200 1 2 3 4 б б б б б. б б Ь Известный 6 Предлагаемый РР Р Р Р Р Р Р Тест-систе" с с с с с с с с с щщваев е е при разведении эшерихиозной сыворотки 1/Т б 6 б 6 6 б 6 б Известньй ПредлагаеР Р Р Р Р, Р Р Р а Р ввы сеевтееевеееатвие вива ивв ватвевееаьеьевеаеьееьтеееаа а ее т теП р и и е ч а н м е. к - коричневый цвет, кр - коричнево"розовый, б - бесцветный,р " розовый, а - аелтьй, с " сини 3.Контрольные лунки 1 - без антигена, 2 - без сыворотки,3 " без коныагата, 4 - беэ перекиси водорода Составитель В.ШамардинТехред М.Моргентал Корректор СЮско Редактор Заказ 2028 Тиражямп иГКНТСССРВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при113035, Москва, Же 35, Рауаскав наб 4(6 Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, у . рУ л.Гага ина, 101 гезультат реакции ю окраске в лунках 1 при разве енин лептослмрозной сыворотки 11/Т) Контроль 1 лунки