Способ выявления микобактерий туберкулеза

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИН С 12 Ц 1 фр) зобреспосо ХХХХЧ, М.,етеринаной дигги мо- цинских огических ринарн ториях бактери я обнар и ви ве лабо ужения воэбущеления кульатологией с поулеза исследматериаловпараФина, коиз приведеннвый способ. туберческихмощьюодним еля туберкулеза тац ы в чистом видЦель изобретен ощение способа спольэобов, енной ют скорение и и сп меси ол Примерлогический м мого паеровскойляют подо 50 еды и исследу материала пасончиком доба асплавленного го параФина, к верхности сме ые диски до 0 асположенные о питательно тологическогопипеткой с балл20-30 капель ро55 С стерильнозастывая на позуют параФиновизолированно р арФороком ательно растираю ницами ивым пести ым пес ступке объеме м со стерильнй ФарФоровойму (в равном до) ис- или в стерильн бавляя к н пользуемую элективную тый патоло оторые,и, обра 5 см,жидкую минеральную питательную среду. ический материал ф асте от тр ГОсудАРстВенный но 14 итетПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОтНРЫт."НЯМПРИ ГННТ ССОР(71) Воронежский сельскохозяйственный институт им. К,Д. Глинки(54) СПОСОБ ВЬИВЛЕНИЯ МИКОБАКТЕРИИТУБЕРКУЛЕЗА(57) Изобретение относится к ветеринарии, в частности к лабораторнойдиагностике туберкулеза животньк,и может быть использовано в медицинских и ветеринарных бактериологических лабораториях для обнаружениявозбудителя туберкулеза и выделения Изобретение относится рии, в частности к лаборатоностике туберкулеза животныхжет быть использовано в мед 1. Исследуемый паериал измельчают нож О 3557166 культуры в чистом виде. Цель и тения - ускорение и упрощение ба. Для этого различные патологические материалы подвергают одновременному обогащению Флотацией микобактериями туберкулеза параФином (дисками или пленкой) и последующему культивированию микобактериями до получения культуры в чистом виде на поверхности жидкой питательной среды. ДиФФеренциацию туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных осуществляют по способности к пигментообразованию и по скорости появления характерного первичного роста на параФиновых дисках и пленке в жидких питательных средах и в субкультурах на яиччых питательных средах. через двойной слой в стеклянную конич костью 50,0 мл) в ляют равный объемжидкой питательнойводят обогащение ми стерильной марли скую колбу (ембъеме 5 ил и добавтой же стерильной среды. Затем про- кобактерияминосительно другого на поверхности смеси.Второй способГотовят по прописиминеральную или элективную жидкую питательную среду, разливают ее по5 5 мл в стерильные стеклянные колбы (емкостью 50,0 мл) и в каждую добавляют кусочек парафина (величиной с горошину), затем среду стерилизуют в автоклаве при 1 атм 20 мин, после остывания которой при комнатной температуре поверхность среды покрыта тонким прозрачным слоем парафина в виде сплошной пленки, под которую добавляют равное количество (5 мл) суспензии растертого в этой же среде стерильной средой исследуемого патологического материала.После посева патологического материала одним из способов колбу закрывают стерильной ватно-марлевой пробкой и оставляют при комнатной температуре на 60-90 мин для флотации микобактерий туберкулеза парафи" ном .(дисками или пленкой) из суспензия исследуемого патологического материала, находящегося в колбе. По ,истечении указанного срока из колбы бактериологической петлей снимают 1-2 парафиновых диска или кусочек пленки парафина переносят на стерильное предметное стекло и производят легкое втирание, для чего несколько раз проводят нижней поверхностью диска по предметному стеклу нли бактериологической петлей соскабливают микобактерии туберкулеза с нижней поверхности парафинового диска или пленки и готовят мазок, его подсушивают, фик сируют над пламенем горелки, окрашивают по Цилю-Нильсену, микроскопируют и изучают морфологию микобактерий до инкубирования. Независимо от результатов микроскопии колбу"с парафиновы 45 ми дисками или пленкой ставят в тер- . мостат при 37,5-38,5 С для выращивания микобактерий и ежедневно проверя,ют,появление первичного роста мико- бактерий туберкулеза, для чего наб.людают за формированием колоний, который независимо от вида микобакте" рий легко обнаруживаются невооруженным глазом на нижней поверхности и краях парафиновых дисков или пленки в течение 1 - 3 - 7 - 10 дней в виде мелких, круглых от бледно-желтого до грязно-серого цвета изолированных ко" лоний, обильно покрывающих нижнюю поверхность парафиновых дисков или пленки. В этот период нижняя поверхность парафиновых дисков или пленки как бы посыпана манной крупой. К 3 - 5 - 7 - 10 дню (срок зависит от уровня микобактериальной обсеменности используемых патологических материалов) инкубировайия колоний микобактерии увеличиваются в размерах и покрывают нижнюю поверхность дисков или пленки сплошным налетом, а по краям дисков или пленки образуют сплошной "ободок", выступающий на поверхности дисков или пленки. В эти же сроки формируется между дисками вначале прозрачная пленка, хорошо обнаруживаемая и не разбивающаяся при легком встряхивании колбы, при этом все диски объединены ею и представляют монолитную массу, полностью покрывающую поверхность питательной среды в колбе.В мазках, изготовленных с дисков или кусочков пленки парафина и окрашенных по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза в этот период физиологически молоды, хороша и равномерно окрашиваются, имеют типичную морфологию.В мазках, изготовленных из прозрачной пленки, микобактерии мелкие, имеют коккообразную форму, окрашиваются равномерно.К 5-10 дню пленка между дисками становится стеориноподобной, морщинистой, хорошо различимой, а позднее - мощной, выступающей над поверхностью дисков, окраска ее идентична цвету колоний на диске. На парафиновых дисках или пленке парафина в эти сроки накапливается значительное количество бактериальной массы и виде толстого слоя. На мазках, изготовленных с дисков и пленки парафина и окрашенных по Цилю-Нильсену,микобактерии имеют типичную морфологию, хорошо окрашиваются.Такая последовательность характера роста типична для всех видов мико- бактерий, при этом скорость появления первичного роста и количество накапливающейся на парафиновой пленке или дисках бактериальной массы прямо пропорциональны уровню обсемеиенности исследуемых патологических материалов микобактериями туберкулеза. Кроме того, у быстрорастущих вариантов первичный рост на парафиновых дисках или пленке появляется к 1 - 2 дню5 15571 инкубирования, а прозрачная пленка1 между ними - к 1 - 3 дню, у медленно- растущих вариантов микобактерий первичный рост и прозрачная пленкаеж- . ду ними появляются к 5 - 7 дню.Предварительный результат по индикации различных видов микобактерий получают через 60-90 мин после внесения парафиновых дисков в жидкую пи тательную среду, зараженную патологическим материалом, или после посева патологического материала под пленку параФина путем микроскопии мазков, изготовленных соскабливанием Флотированных микобактерий с нижней поверхности параФиновых дисков или пленки. Окончательный результат индикации микобактерий туберкулеза можно получить через 1 - 3 - 5 - 7 дней, при 20 низкой обсемененности инФицированных патологических материалов - к 1 О - 12 дню путем обнаружения характерно" го первичного роста микобактерий, инкубируемьк на параФиновых пленке и 25 дисках в жидкой минеральной или элективной питательной среде, и микроскопии окрашенных по Циль-Нильсену мазков, изготовленных соскабливанием, или пленки.П р и м е р 2. Для получения значительного количества массы микобактерий туберкулеза проводят пересев на 3 - 5 пробирок со средой Левенштейна-Иенсена путем втирания нижней поверхностью параФиновых дисков или кусочков пленки. Обильное накопление биомассы наблюдают через 18-24 ч,П р и м е р 3. Для интенсивного накопления и длительного хранения40 бактериальной массы различных видов микобактерий в колбу после появления характерного роста их на парафиновык дисках через 3 - 5 дней). добавляют 10 - 20 мп стерильной элективной45 жидкой питательной среды, которую каждый 2 - 3 мес. заменяют, доливая свежей в том же объеме, предварительно удаляя старую.П р и м е р 4. Для выяснения способности микобактерий к пигментообразованию суспензии исследуемого патологического материала, полученную растиранием его в ступке, разливают по 5 мл сразу в две стерильные колбы емкостью 50 мл, в которые доливают в равном объеме 5 мп) жидкую элективную питательную среду. К этой смеси пастеровской пипеткой с баллончиком 66 6добавляют расплавленного до 50-56 С параФина по 30-40 капель в каждую колбу, которые застывают на их поверхности в виде дисков Р до 0,5 см. Колбы закрывают стерильными пробками и на одной из них надписыв,"ют "свет", на другой - "темнота", последнюю заворачивают в темную бумагу, обе колбы ставят в термостат при 37,5-38,5 С, Если после инкубации в течение 1- 3 - 5 - 7 дней в обеих колбах на параФиновых дисках будут обнаружены колонии микобактерий с оранжевой окраской независимо от действия света, то это скотохромогенная культура микобактерий, если же после такого срока инкубирования обе колбы содержат колонии микобактерий с различной окраской (в колбе "свет" - желтоватая культура, в колбе "темнота" - кремовая), то последнюю колбу без черной бумаги нужно поставить на солнечный свет и цвет колоний через 2-3 дня приобретет желт 5 ю окраску, т.е. если пигментация колоний на дисках появляется только под действием света, то это фотохромогенная культура микобактерий.Определение способности микобакте" рий к пигментообразованию позволяет сократить срок диФФеренциации мико- бактерий этим тестом в 3-4 раза за счет упрощения приемов исследований, так как исключает длительное раздельное выделение микобактерий из патологическйх материалов, затем их культивирование в субкультурах на элективных твердых. яичных средах для накопления бактериальйой массы,дополнительного пересева на зти же яичные среды для изучения способности к пигментообразованию.Формула изобретенияСпособ выявления микобактерий туберкулеза, включающий гомогениэацию исследуемого материала, внесение параФина, посев в жидкую питательную среду, инкубирование с последующим выделением чистой культуры,о т.л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, непосредственно после гомогенизации добавляют питательную среду, после чего вносят расплавленный твердый параФин, инкубированию подвергают полученную смесь, а выделение чисто культуры осуществляют из застывшего параФинового слоя.