Способ исследования функций митохондрий

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН 80138690 51)4 С 01 М 33/4 ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ ДЕТЕЛ КОМ ьский инст вате ой и клиническои имии АН ЛитССРА. Матулис биоя, А Вильнюс ии. АНИЯ ФУНКЦИЙ МЙТО(57) Изобретение отбиофизике, точнее кпредназначено для имеханизма действия осится к биохнмбиоэнергетике,учения п ч 1 г,гармакологическ ии,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРг 10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(56) Методы в биох1975, с. 329. и других биологически активных веществна окислительное фосфорилирование идругие Функции митохондрий. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном сохранении физиологическогосостояния митохондрий, Для этого получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, печени),инкубируют в среде с 0,1-0,15 М НаС 1и 0,005-0,015 М однозамещенным фосфатом калия при рН 7,5. Измеряют характеристики окислительного фосфорилирования. Предлагаемый способ при егоупрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации, обеспечивает сохранение и дажеулучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании. 4 табл.Изобретение относится к биохимии и биофизике, а именно к биологической ,энергетике, и может быть использовано при изучении 1 п у 1 Сго механизма действия фармакологических и других биоло" гически активных веществ на окислительное фосфорилирование и другие функции митохондрий.Цель изобретения - упрощение спо соба при одновременном сохранении физиологического состояния митохондрий.Способ осуществляется следующим образом 15Получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, ,печени), инкубируют в среде, содержащей О, 1-0, 15 М хлорид натрия и 0,005-0,015 М однозамещенный фосфат 20 калия, с рН 7,5 и измеряют характеристики окислительного фосфорилирования.П р и м е р 1. Из печени крысы получают препарат митохондрий, инку бируют в среде, содержащей 0,15 М ИаС 2 и 0,01 М КНРО , и определяют характеристики окислительного фосфорилирования. Одновременно проводят инкубацию в среде по известно му способу, содержащей 0,1 М сахарозу, О,05 М КС 2, 1,5 мМ трис-буфер и0,01 М КН РО Данные окислительного фосфорилирования в средах инкубации митохондрий разного состава приведены в табл.1.П р и м е р 2. Исследуют окислительное фосфорилирование митохондрий в присутствии продигиозана (ПРГ) фармакологического препарата, известного как индуктора интерферона, Сведений об энергетических изменениях под влиянием этого препарата нет. Продигиозан в пределах 5-25 мкг/мл активирует фосфорилирующее дыхание, значительно ускоряет фосфорилирование и увеличивает коэффициент эффективности окислительного фосфорилирования.Данные влияния продигиоэана на окислительное фосфорилирование митохондрий печени крыс представлены в табл. 2.Из табл. 2 видно, что проднгиоэай в пределах указанных концентраций (5-50 мкг/мл) повышает энергетическую эффективность митохондрий.Результаты исследования влияния ионов Са+ на эффект продигиозана на митохондрии приведены в табл. 3.Из табл. 3 видно, что 50 мкмоль Саф +25 мкг/мл продигиозана несколько снижают величину ДК и коэффициен" та АДФ/О на фоне активации дыхания в безакцепторной системе и в койтролируемом состоянии, что свидетельствует о развивающемся разобщении окислительного фосфорилирования.Данные изменения влияния продигиозана на окислительное фосфорилирование митохондрий с увеличением концентрации Са+ представлены в табл.4.Увеличение концентрации Саф до 100 мкмоль вызывает зависимое от дозы продигиозана нарастание фосфорилирующего дыхания, скорости фосфорилирования, величины ДК и коэффициента АДФ/О.Предлагаемый способ при упрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации, обеспечивает сохранение и улучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании.Формула изобретенияСпособ исследования функций митохондрий путем выделения митохондрий из биологического объекта, инкубации изолированных митохондрий в среде, содержащей однозамещенный фосфат калия и соль соляной кислоты при рН 7,5, с последующим определением характеристик окислительного фосфорилирования, о т л и ч а ю щ и й - с я тем, что, с целью упрощения способа при одновременном сохранении физиологического .состояния митохондрий, используют среду, содержащую О, 1-0, 15 И хлорнд натрия и 0,005- 0,015 И однозамещенный фосфат калия.1386900 Продолжение табл,1 Таблица 1 Состав среды инкубациииитактных митохондрий Состав среды инкубации Показатулиинтактных митохондрий 5 Показатели Сахароза0,1 М+КС 10,05 М+трисуфер 1 О1,5 мМ++ДНФ Таблица 2 Концентрация продигиозана, мкг/мл Г Показатели Активность дыхания,ммкАО/мин мгбелкадо добавки АДФ 15,6+0,7 16,710,7 16,810,9 56,8+1,6 55,1+2,1 65,1+2,1 18,0+0,8р( 0,0560,6+2,7 состояние 111 16,8+0,9 19,0+1,4 18,8+0,6 18,5+0,9 79,9+2,7 77,6+5,6 81,213,0 78,4+5,9 состояние 1 Ч+ДНФ Ч ,ммкАО/мин 89,0 ф 4,2 99,1+58 3,52 ф 0,14 3,19+0,2 119,36,5 106,8+5,9р(0,0 р 0,053,34+0,13 3,15+0,14 ДК АДФ/О 1, 69 фО, 07 2,04 ф 0,09 1,99+0,11 1,76+0,03 П р и м е ч а н и е. р - сравнительно с контролем, т.е,с интактными митохондриями без продигиозана в среде инкубации. дыхания,ммкАО/мин мгбелка:до добавки АДФ Изотонический раствор1386900 таблица 3 хАО/мил нг бел Д Алтианоста дэхания доба остояии 111 состояние 17,70 э 0,13 164 х 96 223207 234 т 14 55 т 2 2,7 Ф ПРГ 25 а Саф 5 р с 0,01 со,о р сО,315+01 106,865,9 8,4 85 606127 РГ 100,624,0 23,560,7Р с 0,01 5+3,0 595 ф 26 ПРГ 50 + Са э ионов Саф) 4 и е я а н и е. р " сравнитенио с интвлтными митолондриямн (беэ про яана т И Показатели окислительногофосфорилирования обавки ИРГ, мкг, и Сага, мкм Ь г+ 100 ПРГ 5 + ПРГ 25 +Са" 100 +Са+ 1 РГ 50 + Саг+ 100 ктивнос дыхания,ммк АО/мин мбелкадо добавки АД 17,5+0,9 16,0+О 484+1 стояние 11 54,113,р с 0,05 р (0,05 состояние 1 0,6 с 0,4 126+0,6 11,9 ф 0,7 15,5+О р СО,О+ДН 56,3+2,0 87,4+5,3 2,7+2,62,5 ф 1,9 8,8+1 107, 213, р г 0,05 8, 9+6, 5 109, 1+1 мкАО/м р Со,4,08+ 4,61+0,АДФ/О 03+0,08 2,20+006 01+0, 1 П р и м е ч а н и ер - сравнительно с влиянием100 мкмоль кальция на интактные митохондрии (без продигиозаа). Добавки ярогиоэана мли Саэфмимо 4 17,020,8 9 15,7+О 4 1 О 167207 6 1831 4 25 16,8 а 0,9 14 8 ОЫр со,о 6 19,521 16,5+1 43,1+1 104,854 11,063,99158 117 И 28 193165 254101р сО,О 20,0+1,7 58,2+3,9