Способ оценки функционального состояния митохондрий

СОЮЗ СОВЕТСКИСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК 668 я)5 6 01 й 33/4 ъ мемеъ цс ;.в.Я:ПИСАНИЕ ИЗОБРЕ д ,Ь "е=,Ч е,ВИДЕТЕЛ ЬСТ ТОРСКО показа митохо у инта тных, о функци дри весовои лей; р чения митохон чениям хондри интерва лежнос следуе физиол 0,5 - о функци 6 табл,сукцинат 5 мМ + а -глицерофосфат 3 мМ + Р-оксибутират 3 мМ, По полярограмме рассчитывают следующие показатели: Ч 4 п, Чз, Ч 4 о, СД, ДК, Тр, АДФ/О, ЧЗАк-Чз, где Ч 4 п - скорость дыхания МХ в четвертом метаболическом состоянии по Чансу, нгат 02/мин мг белка,Чз- скорость фосфорилирующего дыхания, нгат 02/ мин мг белка; Ч 4 о - скорость дыхания в четвертом метаболическом состоянии по Чансу после фосфорилирования, нгат 02/ мин мг белка; СД - коэффициент стимуляции дыхания (Чз/Ч 4 п): ДК - коэффициент дыхательного контроля (Чз/Ч 40); Тр - время фосфорилирования, с мг белка; АДФ/О - отношение количества профосфорилированного АДФ к количеству потребленного кислорода; ЧзАк-Чз - изменение ксперимен ь использо о изучению а, а также ных препа ситсяожет бованиаболикарств ия - по шение точно едующим об(МХ) м ифугир Х поляр харозаКНгРО Ф по 20 инат 5 етодом вания, графи,17 М, 5 мМ,нгат, мМ или ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР(71) Н ауч но-исследо вател ьский институтфармакологии Томского научного центраАМН СССР и Томский политехнический институт(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ МИТОХОНДРИЙ(57) Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано в научных исследованиях по изучениюэнергетического метаболизма, а также действия на него лекарственных препаратов. ель изобретения - повышение точности пособа. Способ заключается в измерении Изобретение отно тальной медицине и м вано в научных исслед энергетического мет действия на него ле ратов,Цель изобретен сти способа. Способ осуществляеразом.Получают митохондрии дифференциального центр затем исследуют дыхание М чески. Среда инкубации: са КС 40 мМ, трис-НС 10 мМ ЭДТА 0,2 мМ, добавки АД субстракт окисления - сукц телей функционального состояния ндрий полярографическим методом ктных и экспериментальных живопределении показателя интактности онального состояния (ИФ) митохонформупеИФ= , а р гХ),гдеа -=1коэффициент каждого из показате- (Х) - степень принадлежности знакаждого показателя Х опытных дрий терму, соответству ощему знаданного показателя интактных митой; значение коэффициента в ле 0,5-1,0 свидетельствует о принадти функционального состояния исмых митохондрий к диапазону огических реакций, а в интервале 0- наличии патологических изменений онального состояния митохондрий.1668945 40 45 не противоречит оценке указанных митохондрий с позиций традиционно используемого подхода. Органеллы характеризуются 50 достаточно низкими и сравнимыми скоростЯми контРолиРУемого ДыханиЯ (Ч 4 г и Ч 4 о), хорошей реакцией на АДФ (СД = =3,1), близким к теоретически возможному в условиях окисления сукцината коэффициентом АДФ/О. Умеренное нарастание скорости фосфорилирующего дыхания в ответ на внесение в среду инкубации активаторов сукцинатдегидрогеназы (ЧзАк-Чз = 3,4) демонстрирует отсутствие нагрузки на систему энергопродукции, Время скорости фосфорилирующего дыхания в ответ на добавку в среду инкубации активаторов сук цинатдегидрогеназы а -глицерофосфата и /3 -оксибутирата, нгат 02/ мин мг белка.На основе полученных в опыте полярографических кривых известными способами расчитывают значения Х следующих параметров: Ч 4 п, Чз, Ч 40, СД, ДК, ТР, АДФ/О, Чэ А к-.ЧЗ.Рассчитывают степень принадлежности,и 1 (Х) значений Х 1 измеряемых параметров терму интактные митохондрии, значения весовых коэффициентов а для каждого измеряемого параметра, а затем йоказатель интактности ИФ по формулеИф=а р (Х 1),1=1При значении ИФ 0,5-1,0 функциональное состояние их оценивают как физиологическое, а при значении менее 0,5 - как патологическое.При расчете ИФ по указанной формуле учитывают следующее, Для каждого 1-го измеряемого параметра методами теории нечетких множеств получают вид функции принадлежности р 1(Х) значений Х измеряемых параметров терму интактные митохондрии по формуле 1, при Мср - 51Х : МСР+ Ь+ (25(МСР 1 5 - Х КЛЕВ1при Х 1МСР 1 - ЯЬ 1где Х 1 - значение измеряемого параметра;МСР 1 - среднее арифметическое 1-го параметра в группе интактных животных;31 - исправленное среднее квадратическое отклонение 1-го параметра в группе интактных животных;Клев, Кпр - показатель степени, который задается экспертом, например подбирается в диалоговом режиме работы с вычислительной машиной, для большинства функций принадлежности принята вторая степень,Весовой коэффициент а рассчитывают по формулеЬа=,), Ь1=1где и - число измеряемых параметров Х; 5 10 15 20 25 30 35 Ь - балл 1-10, присваемый каждому 1-му параметру в зависимости от важности этого параметра (баллы присваиваются группой экспертов в процессе диалогового режима работы с вычислительной машиной),П р и м е р 1, Декапитируют интактную крысу, выделяют и исследуют митохондрии мозга согласно указанной методике. Для каждого из восьми параметров дыхательной активности органелл рассчитывают степень принадлежности терму интактные митохондрии, Расчет проводят относительно полученных на достаточно большой выборке средних величин соответствующих показателей (Мср) с учетом их исправленного среднеквадратического отклонения (Я) и весового коэффициента каждого из показателей (а), рассчитываемого с учетом присвоенных группой экспертов каждому 1- му параметру балла (Ь), отражающего вклад данного параметра в совокупное состояние обьекта, а также показателей степени функции принадлежности измеряемого параметра терму интактные митохондриии (Клев и Кп р)Все используемые в расчете величины и полученные результаты приведены в табл, 1,Значение Х (Чз) равно 57,4: Мср (Чз). = = 58,1; Я (Чз) = 1,2, т,е, Мср (Чз) - Я (Чз) Х (Чз)Мср (Чз) + Я (Чз), так как 58.1- -1,2 57,458,1 + 1,2, следовательно фЧз) = 1. Указанным образом определяют ,и 1(Х) для всех остальных параметров. В примере 1 все они (табл, 1) равны 1.Далее определяют показатель ИФ:иИФ=а р 1 (Х) =0,03 1+0,19 1+=1+0,03 1+0,05 1+0,05 1+0,14 1+ + 0,24 1 + 0,27 1 = 1,По величине коэффициента ИФ делают вывод о том, что исследуемые митохондрии полностью соответствуют органеллам интактных животных. Полученный результат10 15 20 25 30 35 5 п 55 фосфорилирования добавленной АДФ, ха рактеризующее совместно с коэффициентами АДФ/О, СД и ДК состояние процессов окислительного фосфорилирования, практически не отличается от такового в интактной группе.Таким образом, по совокупной оценке полученных данных исследуемые МХ находятся в состоянии покоя, хорошо энергизованны, без следов предшествующей гиперактивности, процессы окислительного фосфорилирования полностью сопряжены, что соответствует понятию интактные МХ.П р и м е р 2, Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. Через восемь часов животное погибает. Из мозга погибшей крысы выделяют МХ, исследуют показатели их дыхательной активности. Способам по примеру 1 рассчитывают величину коэффициента Иф (данные для расчета в табл. 2). Расчет показывает, что величина коэффициента ИФ у данных МХ близка к нулю. Иф = =0,03 0,16+ 0,19 0;00+0,03 0,00+ 0,05 х х 0,00+ 0,05 0,00+ 0,14 0,00+ 0,24 0,00++0,27 0,00 = 0,004. Это свидетельствует о наличии в МХ тяжелых, несовместимых с жизнью клетки, патологических изменений,По показателям дыхания органеллы имеют низкую начальную скорость окисления субстрата, извращенную реакцию на внесение в среду АДФ, отсутствие выхода в контролируемое состояние, что характеризует глубокий низкоэнергетический сдвиг, торможение и полное разобщение окислительного фосфорилирования. Полученные данные свидетельствуют о глубоких и необратимых функциональных и органических изменениях в МХ, что согласуется с расчетной величиной коэффициента Иф,П р и м е р 3. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. Через три часа у животного шерсть взьерошена, двигательная активность существенно снижена. Оценка показателей дыхания выделенных МХ мозга (табл, 3) по величине коэффициента ИФ показывает наличие выраженных изменений функционального состояния в диапазоне физиологических, в данном случае компенсаторных,реакций (расчетный показатель входит в. диапазон 0,5-1,0). ИФ = 0,03 0,5+ 0,19 0,5+ +0,050,5+0,05 1,0+ 0,14 0,29+0,24 1,0+ +0,27 0,07=0,500.МХ данного животного характеризуются достаточно высокими скоростями дыхания, выраженной и правильной направленности реакций на АДФ, отсутствием каких-либо признаков разобщения окислительного фосфорилирования, что свидетельствует об отсутствии органических и глубоких функциональных изменений в МХ. Вместе с тем, повышенная по сравнению с интактными МХ начальная скорость дыхания, снижающаяся при энергизации после цикла фосфорилирования, сниженная скорость фосфорилизующего дыхания и минимальная, но уже извращенная реакция на активаторы СДГ говорят о наличии в органеллах выраженного низкоэнергетического сдвига в пределах диапазона компенсаторных возможностей МХ.П р и м е р 4, Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии. Через 3,5 ч наблюдают у животного выраженные проявления церебральной ишемии: сниженная двигательная реакция, бледные глаза, учащенное дыхание, клонические подергивания, переходящие в тонические судороги, слабая реакция на внешние раздражители, Через три часа ишемии крысу декантируют, выделяют и исследуют МХ мозга. Для каждого из восьми исследуемых параметров рассчитывают принадлежность терму интактные митохондрии (табл. 4)Затем определяют показатель Иф Иф = 0,03 1+ 0,19 О+ 0,03 0,14++ 0,24 0,31+ 0,27 0,03 =-0,168. Величина показателя свидетельствует о наличии тяжелых патологических изменений в МХ. Традиционная трактовка результатов указывает на проявление глубокого низкоэнергетического сдвига (снижение величины АДФ/О, Тр, Чз, извращенная реакция на активаторы СД 1). Однако МХ несмотря на выраженное и прогрессирущее снижение компенсаторных реакций (Ч 4 оЧ 4 п) способны сохранять энергетический гомеатаз, поддерживать на минимальном уровне энергозависимые процессы, Видно, что расчетная величина коэффициента Иф хорошо согласуется с имеющимися в МХ патологическими изменениями.. П р и м е р 5. За 30 мин до перевязки обеих сонных артерий вводят крысе антигипоксант бемитил (50 мг/кг внутрибрюшинно). К третьему часу ишемии животное на фоне некоторой общей заторможенности сохраняет активные двигательные реакции. Все внешние признаки выраженной церебральной ишемии отсутствуют, Оценка состояния МХ мозга по показателям дыхательной активности (табл. 5) с последующим расчетом величины коэффициентаИФ =0,03 1+0,19 0,2+0,03 0,37+ +0,05 0,97+0,05 1+0,14 0,99+ +0,24 1+ 0,27 0,79 = 0,773свидетельствует о наличии изменений функционального состояния МХ в диапазоне физиологических компенсаторных реакций,Судя по показателям дыхания МХ наблюдаются начальные явления низко- энергетического сдвига (увеличение - незначительное повышение Ч 4 о на фоне снижения Тр и неизменного МДФ/О), Энергетическая регуляция в органеллах хорошо выражена (высокие значения СД и ДК), компенсаторное торможение СД 1 легко убирается активаторами фермента (Чздк-Чз = 5,8), Таким образом, в отличие от примеров 2, 5 и 3, где коэффициенты ИФ равны 0,168 и 0,5 и, соответственно, наблюдаются явления низкоэнергетического сдвига крайней, глубокой и средней степеней тяжести, у исследуемых МХ-проявления деэнергизации незначительны, что соответствует величине ИФ = 0,773,П р и м е р 6. Под эфирным наркозом перевязывают крысе обе сонные артерии, К третьему часу ишемии у животного наблюдаются внешние признаки циркуля- торной гипоксии - учащенное дыхание, взъерошенная шерсть, сниженная двигательная активность, но у данной особи отсутствуют проявления, характерные для глубокой ишемизации мозга развития судорожной активности, Исследование МХ мозга крысы с последующим расчетом величины коэффициента ИФ (табл. 6) указывает наличие патологических изменений.РИФ = 0,03 0,55+ 0,19 0,19+ 0,03 0,37+ + 0,05 0,48+ 0,05 1 + 0,14 0,1+ + 0,24 1 + 0,27 0,07 = 0,41.Оценка состояния органелл также указывает на наличие выраженного низко- энергетического сдвига, нарастанщих явлений ингибирования СДГ, торможения процессов окислительного фосфорипипвания, Однако в отличие от гримера 4, где ИФ =- 0,168, у животного тяжелая ишемия с судорожными припадками, не наблюдают столь выраженного разобщения окисли тельного фосфорилирования (АДФ/О = 1,8и 1,5 соответственно) и повышение его времени (Тр = 120,0 и 219,0 соответственно).В то же время проявления низкоэнергетического сдвига более яркие по сравнению 10 с примером 3, где у такого же ишемизированного животного ИФ = 0,500, в частности ниже коэффициент АДФ/О, дольше время фосфорилирования, несколько ни.же скорость фосфорилирующего дыхания 15 и величина коэффициентов СД и ДК, Поанализу показателей дыхательной активности,МХ в данном примере имеется больший низкоэнергетический сдвиг, чем в примере 4,20 Таким образом, предлагаемый способпозволяет с высокой точностью определить функциональное состояние МХ. 25 Формула изобретенияСпособ оценки функционального состояния митохондрий, включающий полярографическое определение скоростейдыхания до, после и во время фосфорили 30 рования и времени фосфорилирования вконтрольных и опытных митохондриях, отл и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения точности способа, дополнительно определяют коэффициент стимуля 35 ции дыхания и дыхательного контроля,отношение АДФ/О и разность скоростейдыхания во время фосфорилирования в присутствии и отсутствии активатора сукцинатдегидрогеназы, затем рассчитывают40 показатель интактности ИФ по формулеИФ=а р Х),где а 1 - весовой коэффициент каждого изпоказателей;,и (Х) - степень принадлежности значения каждого показателя Х опытных митохондрий терму, соответствующемузначениям данного показателя интактныхмитохондрий;и при значении ИФ = 0,5-1,0 функциональное состояние митохондрий оцениваюткак физиологическое, а при ИФ 0,5 - какпатологическое.12 1668945 Таблица 5 6 а Редактор И. Шул ректор Т. Палий сгвенно-издательский .омбинат "Патент" ород, ул.Гагарина, 1 Произ аказ 2653 ВНИИПИ Гос оставитель Н. Гуляевехред У,Моргентал Тираж Подписноеенного комитета по изобретениям и открытиям ири ГКНТ СС 13035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5