Способ получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 19) 61 К 39 ЕНИЯ ПЬСТВ атель-,вете при их мор ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ САНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИ(56) Романова Р.Ю. Использованиедифференциального ультрацентрифугирования для выделения субклеточныхкомпонентов микобактерий туберкулеза. - Проблемы туберкулеза, 1981,Р 7, с. 54-56.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРПУСКУЛЯРНОЙИММУНОГЕННОЙ ФРАКЦИИ МИКОБАКТЕРИЙТУБЕРКУЛЕЗА(57) Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИИ, изучающих механизмы формирования протн"вотуберкулезного иммунитета. Цельюизобретения является повышение эффективности способа получения корпускулярной иммуногенной фракции микобактерий туберкулеза. Сущность предлагаемого способа состоит в дезинтеграции микобактерий в конце логарифмической стадии роста (через 16 - 19 чот момента начала культивирования).При этом концентрирование и очисткаполученной иммуногенной фракции осу"ществляется в оптимальных режимахпромывания и центрифугировання, Полученные при реализации предлагаемого способа иммуногенные фракции.микобактерий туберкулеза обладают выраженным протективным действиемоднократном подложном введенииским свинкам. 3 табл.113Изобретение относится к ветеринарной иммунологии и может быть использовано в лабораториях и НИИ, изучающих механизмы Формирования противотуберкулезного иммунитета.Цель изобретения - повышение эфФективности способа получения корпускулярной иммуногенной Фракции микобактерий туберкулеза.П р и м е р 1. Проводят посевмикобактерий туберкулеза (после 3-5пассажей) на жидкую (например, Сотона) и плотную (например, ЛевенштейнаЙенсена) питательные среды, причемв последнем случае в большом разведении (1:640 - 1:1280) и помещают втермостат (37 С),Ежедневно определяют количествоколоний, и по 1 ор, от среднего числа колоний строят кривую размножения(табл.1).Основные стадии роста микобактерий туберкулеза бычьего вида приведены в табл1, В соответствии с полученными результатами бакмассу БЦК для дезинтеграции берут через 16 сут роста, а бакмассу М. Ьоч 1.з (данного штамма) через 19 сут роста.Для получения Фракции оболочек микобактерии в конце лог-периода роста подвергают механической дезинтеграции в соответствии с параметрами, приведенными в табл.2.В качестве среды для суспендирования используют Физиологический раствор (рН 7,0 - 7,2), в который вносят бакмассу, после чего бактериальную суспензию посещают в камеру дезинтегратора, куда добавляют стеклянные бусы, Камеру дезинтегратора охлаждают в ледяной бане и проводят разрушение микобактерий туберкулеза в непрерывном режиме работы. По окончании процедуры разрушения надосадок переносят в сборный сосуд, стеклянные бусы дважды промывают Физиологическим раствором и объединяют с ранее полученным дезинтегратором. Неразрушенные микобактерии и крупные конгломераты удаляют центрифугированием при 2000 я в течение 20 мин. Надосадок собирают, осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при тех же режимах. Эту процедуру повторяют дважды, полученные надосадки объединяют и центП р и м е р 3, Изучение протективного эффекта оболочек БЦЖ и М. Ьо.я на морских свинках,Приготовленную масляно-водную эмульсию оболочек БЦЖ и М. Ьоч 1 з вводят подкожно морским свинкам в область медиальной поверхности бедра однократно в разных дозах.Таблица 1 Стадии роста, сут Микобактериитуберкулеза Лог-фаза Лог-фаза Стационарная фаза С 17 12-16 БЦЖ МусоЬасг.ег 1 цшЬоч 1 з 8 С 20 12-19 Таблица 2 Стеклянные бусы,диаметр 0,1 мм Соотношение бакмасса:Физиологической раствор:бусы 1:1:2 з 1Протективный эффект противотубер-кулезной иммунизации морских свинокприведены в табл,З1 Одновременно животных тем же способом иммунизируют целыми живыми и убитыми БЦЖ. Через 2 мес всех животных подвергают контрольному заражению вирулентными микобактериями туберкулеза и регистрируют падеж в экспериментальных группах в течение последующих 3 мес. Протективный эффект оценивают по средней продолжи- тельности жизни. Как следует из табл,З, оболочки БЦЖ в дозе 0,1 мг на животное и оболочки М,Ьоч 1 з в дозе 0,37 мг на животное индуцируют противотуберкулезную резистентность, не уступающую по средней продолжительности жизни иммунизации вакциной БЦЖ в дозе 1 мг на животное при однотипном способе введения, в чем проявляется иммуногенность полученной по предлагаемому способу фракции оболочек мико- бактерий туберкулеза. Сама по себе масляно-водная эмульсия, целые живые и убитые БЦЖ в масляно-водной эмульсии не защищают животных от заражения туберкулезом. Оболочки М. Ъочз в дозе 0,03 мг на животное не обладают протективным эффектом. 3388594Формула изобретенияСпособ получения корпускулярнойиммуногенной фракции микобактерий туберкулеза, включающий выращивание ми"кобактерий туберкулеза на питательной среде, сбор бакмассы микобакте-рий, их механическую дезинтеграцию,осаждение неразрушенных микобактерий,концентрирование и очистку фракцииклеточных оболочек с последующей лиоФилизацией целевого продукта, о тл и,ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения эффектности способа,сбор .бакмассы микобактерий осуществляют с помощью бус в физиологическом растворе с рН 7,0 - 7,2 в течение 6090 мин при соотношении бак"масса: бусы: физиологический раствор1:2:11,2:2,2:1,3, осаждение неразрушенных микобактерий осуществляюттрехкратным центрифугированием при2000 г, в течение 1520 мин, концентрирование проводят путем центрифугирования надосадочной жидкости при15000 я в течение 6090 мин, а последующую очистку фракции клеточныхоболочек проводят путем постоянногоперемешивания осадка с 0,40,5 Е-ным 30раствором тритона Х"100, добавляемого в соотношении 1:401:50, и последующего отмывания корпускулярнойфракции дистиллированной водой сдвухкратным центрифугированием при1500016000 я в"течение 20 мин.1338859бПродолжение табл.2 4000 об/мин60-90 мин Скорость вращения бусВремя дезинтеграции Таблица 3. Средняя продолжительность жизни, дней Иммуниз ация Доза наживотное,мг Вакцина БЦЖ 82,4 + 13,40 Живые БПЖ в масляно-водной эмульсии 73,8 + 5,31 Убитые нагреванием БЦЖв масляно-водной эмульсии 66 б + 349 Оболочки БЦЖ в масляноводной эмульсии 82,5 ф 10,69 79,8 1 25,40 84,0.+ 14,70 То же 0,3 0,1 Оболочки М, Ьочз в масляно-водной эмульсии 83,5 Т 15,92 80,2 + 15,93 63,316,46 58,7 + 3,49 То же О,1 0,03 Масляно-водная эмульсия Контроль 1,интактные.животные) 68,9 1 17,80 Составитель С. СветлышевТехред П.Олейник Корректор М. Максимишинец Редактор Н. Тупица Тираж 594 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 133035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5