Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции

.С. Синдрисосудиссепсисе уедиатрия,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Семипалатинский госудмедицинский институт(56) Маматкулов Х.М., Цай Тром диссеминированного внутого свертывания крови придетей раннего возраста. - П1984, 9 3, с. 44-48.(57) Изобретение относится к иммунологии. Цель изобретения - упрощениеи повышение точности способа. Из веноэной гепаринизированной крови выделяют мононуклеарные .клетки и отмывают их. К лимфоцитам добавляют эритроциты. быка, сенсибилизированные ктромбину. Смесь инкубируют, центрифугируют и выдерживают в холодильнике,Подсчитывают количество лимфоцитов,образовавших розетки с эритроцитамибыка, на 100 клеток. При содержанииих более 2 Ж диагностируют синдром гиперкоагуляции. Для идентификации лимфоцитов проводят дополнительно люми"несцентную микроскопию.1 334Изобретение относится к медицине,а именно к иммунологии и коагулологиифЦель изобретения - упрощение и па 5вьпдение точности способа диагностикисиндрома гиперкоагуляции.Способ осуществляют следующим образом,Из веноэной гепаринизированнойкрови (3-3,5 мл) на градиенте плотности фиколл-верографина (й=-1,077 г/мл)выделяют мононуклеарные клетки счистотой 85-90%. Выделенные клеткитрижды отмывают от сывороточных белков средой 199. Доводят до рабочейконцентрации 2-3 10 /мл в среце 199.В реакции используют эритроциты быка,сенсибилизированные к тромбкну. Ихполучают следующим образом.20Эритроциты быка отмывают триждыфизиологическим раствором, Из отмытых эритроцитов готовят 10%-нуювзвесь на Физиологическом растворе,К 3,0 мл 107.-ной взвеси эритроцктов 25быка добавляют 1,0 мл О, 1%-наго раствора ализариновага красного приготовленного на физиологическом раст -воре, и тромбина очищенного безплазминогена (10 ед.), растваргннага Зцв Физиологическом растворе (1,0 мл).Тщательно перемешивают и ставят вотермастат при 45 С на 1 ч. Затем эритроциты быка вновь отмывают триждыФизиологическим раствором и готовят27-ную суспензию эритрацитав в Физиологическом растворе. В последующем к0,2 мл лимфоцитов в концентрации2-3 10 /мл добавляют 0,2 мл 27.-нагораствора эритрацктов бьгка, сенсибклизированных тромбином. Смесь кнкубируют при 37 С 10 мин, затем центриФугируют прк 1000 аб/мкн 5 мин и вью,держивают в холодильнике при 4 С 1 чили оставляют на ночь (18 ч),. Далееподсчитывают количество лкмфоцктав,образовавших розетки с эритроцитамибыка (3 эритроцита и более), на100 клеток. Для исключения неспецифическага образования розеток ставили параллсльно 3 пробы: отмытые эритроциты быка к лимфапиты; эритроциты быка, сенскбилизкрованные О, 17.-ным растворам ализаринового красного, и лимфоцкты эритроциты быка, сенсибилизированные алкзаринавым красным и нагруженные тромбинам, и лимфациты. о 85 2Обследована 57 детей, из нкх 16здоровых и 41 с ОРЗ, бронхитам изразличной формой пневмонии.П р и м е р 1. Проведена исследование здаравагс ребенка 2 лет.3,0 мл гепаркнкзированной крови(25 ед/мл) разводят Физиологическимрастворам в 2 раза и наслаивают на3,0 мл фикалл-вераграфина (плотность1,077 г/мл), Центрифугируют 40 минрк 1500 аб/мкн. Снимают с интерфазной поверхности взвесь лимфоцитов иотмывают средой 199 три раза при1000 об/мкн в течение 10 мин затемпроверяют жизнеспособность выделениялимфоцитов по суправитальной окраскес тркпанавым синим к осуществляютподсчет лимфацктав в 1 мл, Готовятрабочий раствор (2-3 10 /мл) лимфоцктав в среде 199. Параллельно с описанной процедурой осуществляют трехкратное отмывание эритрацитов быка готовят 107-ную суспензию в Физиологическом растворе, В 3 пробирки разливают по30 мл 10%-нага раствора эритроцитовбыка. В 1 - ю пробирку добавляют 2,0 млФизиологического раствора, во 2-ю 1,0 мл 0,1%-нага раствора алкзариновага красного и 1,0 мл Физиологического раствора, в 3-ю - 1,.0 мл О, 17 ного раствора ализариновога красногогл 1,0 ил трамбкна в дозе ,0 ед/мл.Трамбин очищенный, без плазминагена,Каунасскога производства Все триопробирки ставят в термастат при 45 Сна 1 ч,. Затем триждь отмывают эритроциты к готовят 2%-ную сусензию наФизиологическом растворе, Ставят параллельна 3 пробы, для чего в 3 пробирки разливают по 0,2 мл суспензиилкмфацитав и соответственно добавляют па 02 мл приготовленных предварительна эритроцитов быка, Пробытщательно перемешивают и ставят втермастат при 37 С на 10 мин, затемцентрифугкр 1 ют прк 1000 аб/мин 10 минк кнкубируют лрк 4 С в течение 18 ч.После инкубацкк все три пробы ресуслензируют к подсчитывают количестволкмфацитав, образовавших розетки неменее чем с тремя эритроцитами быка,В 1-к пробирке розеток не обнаружена, ва втсрай также нет розеток,в третьей выявленыразеткообразующие клетки (кз 100) к которым в од -ном случае прксаединилксь 4 эритроцкта быка, возле другой клетки образовалась палуморчла,34085 Способ диагностики синдрома гиперкоагуляции у детей, больных острой пневмонией, путем исследования кро ви, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью упрощения и повышения точности способа, из исследуемой периферической крови выделяют лимфоциты, определяют в реакции розеткоз 13Для идентификации лимфоцитов проведено дополнительное исследование с помощью люминесцентной микроскопии, Подтверждено наличие лимфоцита в центре розетки зеленым свечением ядра.Таким образом, показана возможность наличия рецепторов к тромбину на лимфоцитах у здорового ребенка. Всего обследовано 16 здоровых детей; средяя величина содержания розеток - 1, 1 ф 0,2. П р и м е р 2. Ребенок Ч., 6 мес. Диагноз: острая двухсторонняя очаговая пневмония, острый период. 3,0 мп гепаринизированной крови (25 ед/мп) разводят физиологическим раствором в 2 раза и наслаивают на 3,0 мп фиколлверографина (плотность раствора 1,077 г/мл). Последующая процедура выделения клеток и постановка проб аналогичны описанным в примере 1В 1-й пробирке розеток не обнаружено. во 2-й - 2 розетки, в 3-й - 9 розеток. К лимоцитам прикрепилось от 3 до 10 эритроцитов быка. Следовательно, в острый период пневмонии экспрессия рецепторов к тромбину более выражена, что обусловлено активацией свертывающей системы, большим содержанием тромбина в кровотоке и возможной сенсибилизацией лимоцитов, это свидетельствует о наличии у больного синдрома гиперкоагуляции. Для подтверждения этого известными методами необходимо провести ряд исследований: определение тромботеста;определение времени рекальцификации; определение содержания фибриногена; определение тромбинового времени;определение протромбинового индекса, запись тромбоэластрограммы, Проведенные исследования показали, что время рекальцификации составляло 115 с; концентрация фибриногена 340 мг Х; тромбиновое время 23 с;протромбиновый индекс 973, ДанныеО тромбоэластограммы: Р - 4 мин, 30 К - 2 мин; мА - 50 мм. Только по одному из проведенных исследований судить о состоянии системы гемостаза не представляется возможным. Анализ коагулограммы (совокупности исследований) свидетельствует о тенденции к гиперкоагуляции, т.е. для обоснования данного вывода необходимо бы" ло провести шесть исследований,Таким образом, предлагаемый способупрощает диагностику гиперкоагуляции. Поскольку способ отражает экспрессию рецепторов лимфоцитов к тромбину, то он обеспечицает повышениеточности диагностики, так как отражает уровень циркулирующего в периферической крови фермента тромбина,который является ключевым в системегемостаза, и его содержание увеличивается при гиперкоагуляции.Пример 3. Ребенок И, 1 г,4 мес. Диагноз: двухсторонняя пнев мония, справа полисегментарная,ДН и, СН. Лимфоциты сенсибилизированные тромбином эритроцитов быка,получают аналогично описанному в примере 1. Количество лимфоцитов, обра зовавших розетки - 14, что свидетельствует о значительной концентрации впериферическом кровотоке тромбина и,следовательно, о более выраженной гиперкоагуляцни по сравнению с примером 25 2. Это связано с более тяжелым и распространенным процессом в легких.Проведенные рутинные исследованиясистемы гемостаза также свидетельствовали о значительно выраженном ги перкоагуляционном синдроме. Так, время свертывания крови по Ли-Уайту составляло 3 мин, время рекальцификации 85, степень тромботеста ЧТ,тромбиновое время 19;протромбиновыйиндекс 957; фибриноген 308 мг 7 Следовательно, по предлагаемому способу можно дать интегральную оценку состояния гемостаза в данный момент, не прибегая к многочисленным рутинным методам исследования.Всего обследован 41 больной, причем среднее содержание розеток при пневмонии составило 8,2+1,1,Способ прост, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов и может быть осуществлен. в любой лаборатории клинической иммунологии. Формула изобретенияСоставитель Л.ПадюковТехред Л. Сердюкова Редактор А.Огар Корректор В. Бутяга Заказ 3958/42 Тираж 76 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Подписное Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 51334085 6образования количество клеток, несу- держании их более 23 диагностируютщих рецепторы к тромбину, и при с- синдром гиперкоагуляции.