Способ получения диагностического иммуноглобулина к вирусу западного нила

,стви ДИАГНОСТИ. ИРУСУ приготов,.(54) ЧЕСК ЗАВА ЕН ИНА ающУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР М ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 3433563/28-1305,05,8215.07.84. Бюл. РВ.П. Николаев и615.373,3(088.8)1. Шмидт О.А. ивирусов и клеши1977, 92-97.57) СПОСОБ ПОЛУЧГО ИИИУНОГЛОБУЛДНОГО НИЛА, включ ление видоспецифического антигенавируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигеном, получениеиммунной асцитной жидкости и выделение из нее иммуноглобулина, о т л ич а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения видовой специфичности иммуноглобулина, иммунизацию мышейпроводят .видоспецифическим антигеном,остаточный вирус в котором инактивируют прогреванием в течение 20 -24 ч пои 36-37 С;Изобретение относится к способу получения диагностических препаратов, содержащих иммуноглобулины и может быть использовано в вирусологической и эпидемиологической практике для выявления и одновременной идентификации 5 вируса Западного Нила и его антигенов прямым иммунолюминесцентным методомИзвестен способ получения диагно" стического иммуноглобулина к флавивирусам подгруппы денге, включающий (О приготовление антигена, иммунизацию мышей этим антигеном, выделение иммуноглобулина из асцитной жидкости мышей (1).Однако известный способ не дает воэможности получить диагностический иммуноглобулин к вирусу Западного Нила, так как видоспецифический антиген вируса Западного Нила содержит небольшое количество остаточного активного вируса, который при имму низации мышей размножается и вызывает в организме интенсивное образование грунпоспецифических антител, реагирующих с другими Флавивирусами.Белью изобретения является повыше". 25 ние видовой специфичности иммуноглобулина к вирусу Западного Нила.Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения диаг" ностического иммуноглобулина к вирусу Западного Нила, включающему приготовление видоспецифического антигена вируса Западного Нила, гипериммунизацию мышей этим антигеном, получение иммунной асцитной жидкости и выделение из нее иммуноглобулина, иммуни зацию мышей провОдят видоспецифическим антигеном, остаточный вирус в котором инактивируют прогреваниемо в течение 20-24 ч при 36-37 С.40П р и м е р. Белых мышей - сосунков в возрасте 2-4 дней заражают вмозг вирусом Западного Нила (штамм,Нр) . Заболевших животных усыпляютэфиром и извлекают их мозг с соблюдением правил асептики. Ткань мозга, 45содержащую вирус Западного Нила,тщательно гомогенизируют в Фосфатномсолевом буферном растворе рН 7,27,4 (на один мозг берут 0,9 мл этогораствора). К полученной суспензии 5 Омозга добавляют двойной объем ацетоона, охлажденного до 2-5 С. Смесьперемешивают 50-60 с и центриф гируют 5-7 мин при 2500-2700 уи 2-5 С.Жидкость пОлнОстью удаЛяют а Осадок 55ресуспендируют в 0,15 М Фосфатномсолевом буферном растворе рН 7,2-7,4,взятом в количестве, равном объемуисходной суспенэии мозга. Взвесьцентрифугируют 30-35 мин при 3500 -4000 и 2-5 С. Надосадочную жидкость, представляющую собой видоспецифический антиген вируса ЗападногоНила, отсасывают. Затем для инактивации остаточного вируса ее прогрева.ют 20-24 ч при 36-37 С. 65 Беспородным белым мышам массой20-24 г два раза с интервалом в6-7 дней внутримышечно (в заднююлапку) вводят по 200 мкл смеси,состоящей из равных объемов видоспецифического антигена вируса Западного Нила и адъюванта следующего сос"таза,вес.%: вазелиновое масло 90,безводный ланолин 10 и вакцина ББЖ500 мг/л.Через 3 недели после первичнойиммунизации проводят реиммунизациюживотных. При этом мышам вводят внутрибрюшинно через день видоспецифический антиген вируса Западного Нилав количествах 100, 200, 300, 400и 500 мкл.Через день после заключительнойинъекции антигена мышам внутрибрюшинно вводят 200 мкл суспензии клетокасцит-саркомы ТО/180, что приводит кнакоплению в брюшной полости животныхасцитной жидкости, содержащей иммуно"глобулины.По мере накопления (через 1525 дней после иммунизации) асцитнуюжидкость собирают путем пункции брюш"ной полости животных и с помощью центрифугирования (20-25 мин при 20002500 С) освобождают ее от сгустковфибрина и клеточных элементов.Иммуноглобулин иэ асцитной жид"кости выделяют осаждением этиловымалкоголем по Кону или хроматографиейна колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.Присоединение к иммуноглобулинуфлуоресцеинизотиоцианата проводят вщелочной среде при рн 8,9-9,0, температуре 2-5 С и постоянном помешивании реагентной смеси в течение 18 ч.Содержание иммуноглобулина в реагентной смеси должно составлять 1-1,2.Флуоресцеинизотиоцианат берут из расчета 2-2,5 сг на 100 мг иммуноглобу"лина.Очистку полученного люминесцирующего иммуноглобулина от свободногонесвязавшегося с белком Флуоресцениэотиоцианата осуществляют с помощьюдиализа против Фосфатного буферарН 7,2-7,4 с последующей хроматографией на колонке с Дауэксом 1 х 4 илиСефадексом Г.Подлинность получаемого продуктаподтверждают его титрованием с антигенами различных флавивирусов (контроль активности и специфичности).Пример титрования диагностического люминесцирующего иммуноглобулинак вирусу Западного Нила,Культуры клеток, чувствительные кфлавивирусам (например, ВНКилиСПЭВ), выращенные на стеклянныхпластинках, помещенных в пробиркуили Флаконы с питательной средой,инфицируют различными флавивирусамиЧерез 20-24 ч стеклянные пластинкис монослоем клеток отмывают от питательной среды 0,15 М раствором хлорида натрия, высушивают и фиксируют 15-20 мин холодным (2-5 ОС) ацетоном. Люминесцирующий иммуноглобулин .доводят до содержания белка 1%, добавляя 0,01 М фосфатный солевой буферный раствор рН 7,2-7,4 или концентрируя 5 препарат выпариванием. Далее из люминесцирующего иммуноглобулина готовят серию двукратных разведений на фосфатном солевом буферном растворе (от 14 до 1 г 128), Каждое разведение смешивают с равным количеством альбу- мина, меченого родамином (производства ИЭИ им. Н.Ф.Раиалеи), взятого в рабочем разведении. Таким образом получают конечные разведения люминесцирующего иммуноглобулина от 1;8 до 1:256. Эти конечные разведения наносят тонким слоем на фиксирован" ные препараты клеточных культур, инфицированных флавввирусами, и помещают их на 30 мин во влажную ка" 20 меру. Затем препараты ополаскивают водой, на 10 мин погружают в фосфатный солевой буферный раствор рН 7,2- 7,4, снова ополаскивают водой и высушивают при комнатной температу ре, В заключение окрашенные препараты просматривают под люминесцентным микроскопом, используя водноиммерсионный объектив х 70 и окуляр х 5.Регистрируют интенсивность свечения вирусных антигенов, локализованных в цитоплазме клеток препаратов, обработанных различными разведениями люминесцирующего иммуноглобулина.Оценка активности и специфичности диагностического люминесцирующего 35 иммуноглобулина к вирусу Западного Нила представлена в табл.1.Иэ приведенных в табл.1 данных вид-: но, что испытанный образец диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила имеет красящий титр 1:64 и слабо окрашивает или вообще не окрашивает антигены других флавивирусов. Такой препарат в рабочем разведении 1:32 может быть использован для выявления и одновре менно идентификации вируса Западного Нила.Пример использования диагностического люминесцирующего иммуноглобулина к вирусу Западного Нила для одномоментного выявления и идентификацииэтого возбудителя,Культуры клеток, выращенные настеклянных пластинках, заражают различными флавивирусами. Через 20-24 чстеклянные пластинки с клетками отмывают, клетки фиксируют ацетоном.На монослой клеток наносят диагностический люминесцирующий иммуноглобулин к вирусу Западного Нила, взятыйв рабочем разведении (1:32) и содержащий рабочую дозу альбумина, меченого родамином. Через 25-30 мин клетки отмывают, высушивают и просматривают под люминесцетным микроскопом,отмечая препараты со светящимисяклетками., Эксперименты показывают, что клетки со светящейся цитоплазмой имеютсяв культурах, зараженных вирусом Западйого Нила, а в культурах, зараженных вирусами японского энцефалита,энцефалита Сент-Луис, желтой лихорадки, клещевого энцефалита, денгетина 2, незараженных, подобных клеток нет.Результаты сравнительных испытаний иммуногиобулина к вирусу Западного Нила, полученных предлагаемыми известным способами в различных серологических местах, представленыв табл, 2.Данные, приведенные в табл 2, по".казывают, что иммуноглобулин, полученный предлагаемым способом, имеетболее вЫсокую видовую специфичностьпо сравнению с иммуноглобулином,приготовленным известным способом.Этот вывод вытекаеТ из сопоставлениягомологичных титров (с антигеном вируса Западного Нила) и гетерологичных титров (с антигенами другихфлавивирусов, наиболее близких в антигенном отношении к вирусу Западного Нила).Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить видовую специфичность иммуноглобулина в 8-16 рази точнее идентифицировать вирус Западного Нила среди других флавивирусов.,Таблица Интенсивность свечения вирусных антигенов в препаратах, обработанных разведениями иммуноглобулина Антигенывирусов иаеваефчаее Мф 1 г 8 1316 1332 ят 164 1:128 1:256 ЗападногоНила 4+ 4+ Японскогоэнцефалита 2+ 1+ ЭнцефалитаСент-Луис 1+ Ильеус Денге типа 2 Желтой лихорадки Клещевого энцефалита Т а б л и ц а 2 Обратные величины титров антител в серологических местах Реакция связыва- ния 64 ЗападногоНила512 512 Полученныйпо предлага- Японскогоемому спосо- энцефалитабу 16 8 Энцефалита Сент-Луис 832 ф 512 128 512 Полученный . Японского .по известно- энцефалита 512 му способу 64 256 Энцефалита Сент-Луис 8 32 256 32 Илъеус ВНИИПИ Заказ 4867/6 Тираж 688 Подписноеф Вамв аююи филиал ППП фПатентф, г. Ужгород, ул, Проектная,4 Испытуемыйиммуноглобулин Антигенывирусов Ильеус 16ЗападногоНила Реакция тормо" ,ження непрямой Прямой метод флуоресцирующихантител