Способ определения глюкозы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 9) (11) 1 А С 01 И 27/46 МИТЕТ СССРЙ и отнРьпий и ф САН ИЗ БРЕТЕН К АВТОРСН(прототи зу чно СУД ДРСТВЕННЦЙО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕН 74891/18-25.07.83,Бюл. Ь" 28Ю, Кулис, В. -С. А. Лауринавичявичене, М,В.Песлякене,ихман, А.Б.Галицкий и Ю.В,251(088.8)атиани Л.С,Ферментные меиза,И."Наука"1969,с 8-27ент США М 3539459 й 27/46, опублик. 1970 ) 4)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫс использованием глюкооксидазноимембраны, заключающийся в измеренпараметров ячейки при проведениизлектролиза в растворе, содержащеанализируемое вещество, о т л и чю щ и й с я тем, что, с целью пощения точности измерений, передизмерениями в глюкооксидазную мемну вводят дополнительно пероксида электролиз проводят в слабощелорастворе, в который вводят ферронид калия в концентрации, соответствующей предельному току,Изобретение относится к исследованию и анализу материалов путемопределения электрохимических параметров, а точнее, к электрохимицеским методам анализа физиологически активных соединений в присутствииФерментов.,Известен способ определения глюкозы с использованием Ферментов,заключающийся в измерении параметров 1 Оячейки Ьри проведении электролиза врастворе 1).Недостаток способа связан с одноразовым использованием Ферментови применением сложной аппаратуры 5Определение глюкозы в крови требуетудаления белков.Наиболее близким по техническойсущности к предлагаемому являетсяспособ определения глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающийся в измерении параметров ячейки при проведении электролиза в растворе, содержащем анализируемое вещество21. 25Недостатки известного способазаключаются в том, что при погружении"электрода в исследуемый растворглюкоза проникает в мембрану, гдепод действием Фермента образуется зопеоекись водорода, электрохимическоеокисление которого осуществляетсяпри О,ц В, Способ недостаточно селективен и точен, так как при этомпотенциале окисляются также другиевещества, находящиеся в реальныхбиологических расгворах (аскорбиновая кислота, мочевая кислота, аминокислоты и т.д,),Цель изобретения - повышение точности измерений,Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определения глюкозы с использованием глюкооксидазной мембраны, заключающемуся в измерении параметров ячейки при проведении электро-иза в растворе, содержащем анализируемое вещество, передизмерением в глюкооксидазную мембрану вводят дополнительно пероксидазу50а электролиз проводят в слабощелоцном растворе, в который вводят Ферроцианид в концентрации, соответствующей предельному току,П р и м е р 1, 30 мг глюкооксидазы, 50 мг пероксидазы и 100 мгальбумина растворяют в 1 мл 0,0 1 Мфосфатного буферного раствора рН 7,2; 0,1 М КС 1, Смесь обрабатывают0,08 мл 253-ного глутарового альдегида и 0,75 мл выливают на стеклянную подложку площадью 25 см. Высушенную мембрану толщиной 0,1 мм идиаметром 2 мм накладывают на токоподводящий электрод и покрывают диализной мембраной.Результаты определения глюкозыпри помощи мембраны, содержащейглюкооксидазу и пероксидазу, в буферных растворах ( 0,01 М Фосфатныйбуфер рН 7,2; 1 мМ ферроцианида калия, 25 С ) представлены в табл,1.П р и м е р 2, Каталитическуюмембрану изготавливают из 30 мгглюкооксидазы и 30 мг пероксидазыкак в примере 1.Результаты определения глюкозы наплатиновом электроде в буферномрастворе в зависимости от концентрации ферроцианида калия ( рН 7,2;25 С; концентрация глюкозы 1,2 мМ;о0,1 В) представлены в табл.2,Данные табл.2 показывают, чторезкая зависимость от концентрацииФерроцианида калия наблюдаетсядо 1 мМ,П р и м е р 3. Смесь изготавливают из 30 мг глюкооксидазы и 0 мгпероксидазы аналогично примеру 1,но поливают не на стеклянную подложку, а на диализную мембрану. Высушенную мембрану толщиной 0.05 ммнакладывают прямо на токоотводящийматериал и прикрепляют резиновымкольцом. Определяют колицество глюкозыдесятикратно разбавленной 0,01 мМ фосФатным буферомрН 7,2; 0,1 М КС 1)крови, Для определения остатоцноготока в крови 2 мл десятикратно разбавленной крови обрабатывают 1 мгглюкооксидазы и 1 мг каталазы дополного удаления глюкозы в течение20 мин, Определение глюкозы проводяткак в других примерах.Результаты определения глюкозыв кровистеклоуглеродный электрод,ОВ, концентрация КГе (СМ)1 мМ;0,01 М Фосфатный буФер рН 7,2;и = 5) представлены в табл.3,Из табл,3 видно, что величинаостаточного тока не превышает 1,так как основные электрохимическиактивные вещества - аскорбиновая,мочевая кислоты - не окисляютсяпри нулевом потенциале, Способопределения глюкозы обладает высо1032 ЙО 1 15 когда электролит выполняется при25 ЗО 35 40 Платиновыйэлектрод СтеклоуглеродныйэлектродПотенциалэлектрода, В,отн.Ац/АдС 1 Ток, мкА/см 2.Ток, мкА/см 8,7 0,3 10,1 10,1 0,2 0,1 10,1 9,0 0,0 кой точностью, коэффициент вариациине превышает 23 при и = 5.П р и м е р ч. Ферментную мембрану из 30 мг глюкооксидазы и 50 мгпероксидазы изготавливают и накладывают на платиновый электрод аналогично примеру 3, Мембрану по прототипу готовят в отсутствии перокси.дазы.Предлагаемый способ определенияглюкозы по сравнению с прототипом1 предлагаемый способ - 1 мМ ферроцианида калия, ОВ,стеклоуглеродныйэлектродотличается селективностьюи точностью,Данные табл,1 показывают, что согласно предлагаемому способу аскорби-новая и мочевая кислоты не мешаютопределению глюкозы, тогда как согласно прототипу концентрация глюкозы, определенная в смесях, в трираза превышает в буферных растворах.В глюкооксидазной мембране содержащей пероксидазу и ферроцианидкалия, происходят следующие процессы:Глюкоза + 0+ Глюкооксидаза - Глю 4конолактон + Н 0; НО + 2 Ге(СЧ)++ 2 Н +Пероксидаза - 2 Ге(СЙ +2 НО,Восстановление образующегося ферроцианида приводит к генерации токав ячейке.Катодный ток восстановленияферроцианида мало меняется(до 0,18),однако резко падает при более высокихзначениях потенциала.Это определяет наибольший потенциал (0,18) действия ячейки. Наложениеотрицательного потенциала, к примеру0,1 В, приводит к катодному восстановлению кислорода, поэтому являетсязначительным остаточный ток, величина которого меняется от концентрацииглюкозы. Именно этим определяется потенциал действия ячейки 0-0,1 8 отн,насыщенного Аа/АдС электрода. Таккак потенциал Ао/АаС электрода меняется при изменении концентрацииКС от насыщенного раствора до 0,1 Мв интервале 0,201-0,311 8 отн,н.в.это требование проведения электролизапри нулевом потенциале отн. Ац/Я 9 С электрода полностью и однозначно задае; условия реализации способа.Очевидно, вместо Ач 1/АцС электрода могут быть применены другие элект. роды: каломельный, водородный и т.д,Но тогда способ будет реализован,электрод), + О,"01 8 (нормальный водородный э трод) и т дВыбор рН 7, 2 ооус ловле н физ иологическим значением этого параметра. Способ применим и при более высоких рН, однако в более щелочной области уменьшается каталитическая активность ферментов. С этим связано уменьшение тока,Так,если при рН 7,2 и 0,8 мМ глюкозы ток ячейки оавен 9,0 мкА/см то при рН 7,36 он равен 8,7 мкА/см, а при рН 7,5 - 6,3 мкА/см.Ток ячейки, реализующий предлагаемый способ, зависит от концентрации ферроцианида калия, Из данных табл,2, видно, что при увеличении концентра ции ферроцианида до 1 мМ ток увеличивается, а при концентрациях соединения выше 1 мМ практически перестает меняться. Для того, чтобы ток ячейки не зависел от концентрации медиатора, при меняются такие его количест,ва, которые соответствуют предельному току, При определении глюкозы в проточных датчиках с целью экономии реагента применяется 1 мМ раствор, но систе-, ма также хорошо действует с использованием 2 или 3 мМ ферроцианида.Табл и ц а 1Т10 321101 Продолжение табл,Стеклоуглеродныйэлектрод Платиновыйэлектрод Ток, мкА/см Ток мкА/см ат ефем ЕМКонцентрация глюкозы 1 мМ; Концентрацияглюкозы 0,8 мМ.15 Таблица 2 0,125 0,25 0,50 1,0 2,0 3,0 5,0 10,0 Ток ячейки,мкА/см 2,61 6,211 7,92 10,32 10,68 11,0 Й 11,10 11,10 Таблица 5 Концентрация глюкозы,Кровь Ток электродамкА/см Остаточный ток мг 3 Крысиная 5, 221: О, 12Бычья 6,16 ф 0,11 Т а б л и ц а Предлагаемыйспособ Содержание( концентрация) Прототип 11,2 мкА/см Глюкоз а ( 1 мМ )Глюкоза ,0,03 мМ) Аскорбиноваякислота 1 1 ММ ) 20,95 мкА/см 20,003 мкА/см Мочевая кислота0,03 мМ) Составитель Г.БоровикТехред Т.Маточка Корректор М,Демчик Редактор А,Лежнина Закаа 5395/50 Тираж 873 Подписное 8 НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, ЖРаушская наб д. ч/5