Способ получения полиэлектролитных комплексов

Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ н 1992523(22) Заявлено 270281 (21) 3254917/23-05с присоединением заявки Нов Р 1 М К з С 08 Г 226/06 Л 61 К 39/04 Государственный комитет СССР по делам изобретений,н открытийДата опубликования описания 300183 тафаев, В.В. Нико Петров и Р.М. Хаи баиов, М. И. М Норимов, Р.В 72) Авторы изобретен В.А, К Л.Ш(54 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТКОМПЛЕКСОВ Изо биолог и кретно тролит кового с кват ридинам рующим 5 о способа бразовани и во взаи лабощелоч рН 7-11 о 0,2 М омпоненто ь предлагаемо я в комплексо биополимерами ОБДТ и ПЭ в ых растворах ой от 0,05 М соотношении Сущносаключает одействых буфеонной силри 4-505. ретение относится к синтезу чески активных соединений, ко к способу получения полиэлекных комплексов очищенного белдерирата туберкулина (ОБДТ ) рнизованными поли-винилпии (ПЭ ), обладающих стимулидействием на иммунную систему10Указанное свойство соединенийпозволяет применить их в биологии ив медицине, конкретно в иммунологии,Известно, что ПЭ являются мощными иммуностимуляторами, обладающиминеспецифическим активирующим действием на иммунную систему и способныобразовывать устойчивые полиэлектролитные комплексы с бнополимерами 1 1.Наиболее близким к предлагаемомуявляется способ получения полиэлектролитных комплексов взаимодействием слабого иммуногена - бычьего сывороточ,ного альбумина (БСА ) с кватернизованным поливинилпиридином 2),Иммунизация:полученными устойчивыми при физиологических значенияхрН и ионной силы комплексами вызывает иммунный ответ с накоплением БСА-:специфических антителобразующих клеток. (АОК ), число которых значитель 4 но превьыает количество АОК, накапливающихся при раздельном введении животным БСА и указанных ПЭ. В аналогичных условиях чистый БСА сам по себе не индуцирует антителообразования. Однако комплексы БСЛ-ПЭ не могут найти широкого применения, так как получение высоких титров антител против БСА не является актуальным для современной иммунологии.Цель изобретения - получение высо коиммуногенных соединений, обладающих туберкулин-специфической активностью.Поставленная цель достигается тем, что,согласно способу получения полизлектролитных комплексов взаимодействием иммуногена с кватериизованными поли-винилпиридинами в качестве иммуногена используют очищенный белковый дериват туберкулина.992523 чение 30 мин. Затем доводят рН смеси до 7,2, упаривают на роторномиспарителе при 37 С, лиофильно высушивают и используют в дальнейшем.дляиммунизации.5 Комплексообраэование регистрируютметодами турбидиметрического титрования, скоростной се 1 иментации и гельхроматографии.П р и м е р 3. Изучение иммуно генности комплекса ОБДТ-ПЭ. Полученный комплекс ОБДТ-ПЭ(пример 1 )по 0,3 мл внутрибрюшинно вводят мышам линий С 57 В 1 и СВА из расчета450 мкг, связанного в комплекс ОБДТна мышь. Через 10 дней мышей забивают и определяют число АОК в селезенках мьваей по стандартной методикеЕрне с использованием эритроцитовбарана, нагруженных исходным ОБДТ спомощью СгС 1 6 НО.В качестве контроля используютраствор ОБДТ в тетраборатном буферес рН 9,2, которым по 0,3 мл из расчета 450 мкг на мышь иммунизируютконтрольных мышей, Число АОК регистрируют так же, как и для комплексаОБДТ-ПЭ.П р и м е р 4. Изучение иммуногенности комплекса ОБДТ-ПЭ. Проводят аналогично примеру 3. Данные показывают повышение иммуногенности 1ОБДТ, связанного в комплексы с ПЭ, посравнению с исходным ОБДТ.При исследовании комплексов ОБДТкак с ПЭ, так и с ПЭобнаружеЗ 5 но повышение иммуногенности в 2025 раз, по сравнению с исходным ОБДТ.Однако иммуногенность комплексаОБДТ-ПЭвыше, чем комплекса ОБДТПЭ, поэтому его использование для 40 иммунизации животных является наибо 45 55 формула изобретения 60 65 Необходимые для проведения реакции концентрации ОБДТ и ПЭ выбираютисходя из дозы ОБДТ, необходимойдля иммунизации данного вида лабора.торных животных, и из требования,чтобы в системе не присутствовалисвободные, не связанные в поликомплекс компоненты. Последнее достигается изменением исходных соотношений компонентов в смеси с последующим анализом растворов методами скоростной седиментации и гель-хроматографии. При весовом соотношении компонентов в поликомплексе, равном 1:5(0,134 г/дл ОБДТ и 0,69, г/дл ПЭ ),в системе отсутствуют свободныекомпоненты.Реакцию проводят при смешении равных объемов растворов ОБДТ и ПЭ, доведенных до рН исходного буфера, Смешение лучше проводить на магнитноймешалке, при умеренном перемешивании,с магнитом, помещенным в подходящуюпластиковую оболочку (полиэтилен,тефлон ) в течение 20-30 мин.Реакцию проводят при температуреот 4 С до 50 С . После ее окончаниясмесь растворов доводят до выбранного рН, упаривают на роторном испарителе при 25-37 С и лиофильно высушивают. Полученные порошкообразныепродукты в дальнейшем используют дляфизико-химических исследований и имнизации животных. Все растворыдля иммунизации готовят на стерилизованной воде,П р и м е р 1. Комплекс стандартного препарата ОБДТ (препарат РР 0-Ленинградского Института вакцин исывороток ) с сополимером 4-винил-йэтил пиридиний и 4-винил-й-цетилпиридиний бромидов(100 " 90,в+иИ - средневязкостная мол. мас.200000 Д ) - ПЭ.Равные объемы (5 мл ) растворов0,134 г/дл ОБДТ и 0,680 г/дл ПЭ в тетраборатном буФере (рН 9,2 )смешивают при 20 С при умеренномперемешивании на магнитной мешалкес оправленным в полиэтилен магнитом,в течение 20 мин. Затем доводят рНсмеси до 9,2, упаривают на роторномиспарителе при 37 С, лиофильно высушивают и используют в дальнейшемдля иммунизации. П р и м е р 2. Комплекс стандарт ного препарата ОБДТ (РРО- ) с поли-винил-й-этилпиридиний бромидом (,100 О 90% И =200000 Д)-ПЭ.а+иЧ. Равные объемы (5 мл ) растворов 0,134 г/дл ОБДТ и 0,680 г/дл ПЭв тетраборатном буфере рН 9,2 ) смеьявают при 25 фС при умеренном перемешивании на магнитной мешалке с оправленным в полиэтилен магнитом в телее актуальным и позволит проводитьработы по изучению ролиантител против микробактерий, испольэовать комплекс для аналитических и диагностических целей как в иммунологии, таки в медицине. Полученные вышеописанным способом высокоиммуногенные комплексы позволят сэкономить большое число лабораторных животных, используемых для получения иммунного ответа к ОБДТ и время, необходимое для получения желаемого титра антител. Способ получения полиэлектролитных комплексов взаимодействием иммуногена с кватернизоэанными поли- винилпиридинами, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью получения высо коиммуногенных соединений, обладающих туберкулин-специфйческой активностью, в качестве иммуногена исКорректор О. Билак Заказ 365/29 Тираж 492 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 пользуют очищенный белковый дериваттуберкулина. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Кабанов В.А, и др. Синтетические полиэлектролиты и регуляция отдельных этапов иммуногенеза. Итоги йауки и техники, ВИНИТИ АН СССР, "Иммунология", т. 7, 1978, с, 223.2. Кабанов В.А. и др. Йммуногенность комплекса бычьего сывороточного альбумина с поликатионом, нагруженным гидрофобными боковыми группами, ДАН СССР, т, 243, 1978, с, 1330-1333 (прототип ).