Способ получения гибридов соматических клеток

союз советснихсоциАлистичеснихРЕСПУБЛИН 9) (П) 1) С 125 0 ТОРСИС МУ С б Лашкевич и вирус.8) Сэвидж Р,979, с.1740 я УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРделАм изОБРетений и ОтнРытий ПИСАНИЕ ИЗОБР(71) Институт полиомиеных экцефалитов(5 б) 1. Рингертц Н,И,Гибридные клетки. М.,(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИ)1 ОВ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК путем скрещива ния родительских клеток, выращиван на питательной среде монослоя, сос ящего из смеси родительских и гибр ных клеток, рассев смешанных культур, удаления из культуральных флаконов родительских клеток и культивирования оставшихся гибридных клеток дообразования колонии, о т л и ч а ю -щ и й .с я тем, что, с целью улучшения воспроизводимости и снижениятрудоемкости способа, рассев клетокпроизводят при соотношении:3-1:5,удаление из культуральных флаконовродительских клеток осуществляют путем обработки смешанных культур раствором трипсинапри Зб)С в течение 1-5 мий двух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещнвания до полного удаления всех родительских клеток.Изобретение относится к области генетики соматических клеток, касается гибридизации соматических клеток, а именно выделения гибридов,Выделение гибридов является одним из этапов способа гибридизации соматических клеток, Соматические гибриды широко используются в различных областях биологической науки, в частности в генетике, онкологии, вирусологии, биологии клетки, биологии 1.0 развития, В последнее время сделаны первые попытки использовать гибриди зацию соматических клеток для решения важных практических вопросов (лечение рака и инфекционных заболе ваний с помощью моноклональных антител синтезированных в гибридах клеток, получение интерферента и его очистка, выведение хозяйственно важных видов растительных гибридов) ОГибриды соматических. клеток получают слиянием двух или несколько клеток с образованием гибридной клетки,Для этого смесь родительских клетокподвергают определенной обработке,при которой часть клеток сливаетсяи образуются гибриды, состоящие из2-3 родительских клеток. Следующийэтап работы заключается в выделениичистой, желательно клональной, куль- ЗОlтуры гибридных клеток из смешаннойпопуляции. Как правило, гибридныеклетки растут медленнее родительских и саставлжот небольшуо частьпопуляции, поэтому их выделение . 35представляет значительные трудности, В настоящее время для этой целииспользуются два способа 1, неселективный и селективный, Неселективный способ заключается в том,что,Щединичные гибридные клетки механически выделлот из смеси с родительскими и получают из них клональныекультуры. Способ отличается чрезвычайной трудоемкостью, так как длятого чтобы получить несколько гибридных клонов приходится выцелятьогромное количество клеток. Кроме того, получение клонов из одной клеткивозможно только при использованиипосуды и питательных сред высшегокачества. Более широко используетсяселективный способ выделения гибрид;,"ных клеток, который заключается втом, что скрещивают мутантные клетки (например, дефектные по определен ным Ферментам, ауксотрофные или тем-пературочувствительные мутанты),смесь родительских и гибридных клеток культивируют в условиях, способствующих размножению только гибридных 60клеток (селективные среды, непермиссивная температура), Недостаткомспособа является то, что он позволяет скрещивать только мутантные клетки. Способ довольно сложен, так как 65 требует создания селективных условий (питательные среды, темлература), Кроме того, на определенном этапе при использовании этого способавезникает необходимость в очень редком рассеве культур (1:20), во-первых, для того, чтобы избежать метаболической кооперации между гибридными и родительскими клетками, и,во-вторых, для получения клональныхлиний гибридных клеток, что в своюочередь требует питательных сред ипосуды высшего качества.Целью изобретения явЛяется улучшение воспроизводимости и снижениетрудоемкости способа, .Для достижения цели в способеполучения гибридов соматических клеток путем скрещивания родительскихклеток, выращивания на питательнойсреде монослоя, состоящего из смесиродительских и гибридных клеток, рассева смешанных культур, удаления изкультуральных флаконов родительскихклеток и.культивирования оставшихсягибридных клеток до образованияколоний,рассев клеток производятпри соотношении 1:3-1:5 удаление изкультуральных Флаконов родительскихклеток осуществляют путем обработкисмешанных культур раствором трипсина при 36-38 аС в течение 1-5 мин сдвух-трехкратным повторением в течение 2-3 недель после скрещиваниядо полного удаления всех родительских клеток,П р и м е р 1. Выделение соматических гибридов при скрещивании в монослае перевиваемых клеток мыши Ваки диплоидных;Фибробластов человека,В качестве родительских клетокберут перевиваемые клетки опухоликрыши и диплоидные эмбриональные фибробласты человека. Обе культуры снимают са стекла при пассаже с помощьюО,5-ного раствора трипсина при37 еС в течение 1-2 мин. После слияния родительских клеток в монослоепутем обработки их раствором полиэтиленгликоля, смешанные культурыв течение 24 ч культивируют в средеИгла с 10 бычьей сыворотки. Затеммонослой рассаживают из расчета 1:3или 1:5, Через 2-3 дня в культурахобразуется монослой, соСтоящий изродительских мышиных, родительскихчеловеческих клеток и гибридов, полученных от их скрещивания. Для удаления родительских клеток из смешенных культур их обрабатывают0,25-ным раствором трипсина при Зб 38 С в течение 1-2 мин, Отщепившиеся при обработке трипсином родителькие клетки и те гидриды, степень адгезивности которых близка к родитель.ской, смывают со стекла средой иудаляют из культуральных флаконов.Гидриды с большей чем у родительс984215 Составитель А. МакаровРедаКтор О. Юркова . ТехредМ,Костик Корректор А, ИльинГ. Заказ 8252/7 Тираж 523 . ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская. наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", гужгород, ул. Проектная, 4 кихклеток, адгезивностью, при этом остаются на стекле. Их заливают средой Игла с 10 бычьей сыворотки н культивируют до образования моно- слоя, после чего обрабатывают трипсином, как описано выше. Для полного удаления родительских клеток из популяции достаточно обработать трипсином смешанные культуры после слияния 2-.3 раза. В результате на стекле культурального флакона оста ются отдельные колонии гидридных клеток. Каждая колония представляет собой потомство одной гидридной клетки. Для получения клональных линий каждую колонию отдельно снимают со 5 стекла путем обработки смесью равных количество 0,5-ного раствора трипсина и 0,04-ного раствора версена при 37 ОС в течение 3-4 мин и культи; вируют в среде Игла с 10 бычьей сыворотки,Способ основан на том, что часть образовавшихся при скрещивании в монослое гибридных клеток обладаетбольшей адгезивностью, чем оберодительские культуры, Благодаря этому родительские клетки могут бытьудалены иэ культуральных флаконовпосредством мягкой обработки трипсином, а гибриды с большей адгезивностью остаются на стекле и используются для получения чистых культур.Кроме того, присутствие в культурахнебольшого постепенно уменьшающегосяколичества родительских клеток в течение 2-3 недель после слияния кондиционирует питательную среду, чтоспособствует лучшему выживанию и размножению отдельных гибридных клеток,которые образуют на стекле флаконаколонии, представляющие собой потомство одной клетки. К времени полного удаления родительских клеток изкультур гибридные колонии достигаютдостаточно большого размера и могут,быть использованы для получения клональных линий гибридных клеток.