Способ выделения -зависимой супероксиддисмутазы из печени крысы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Сеюз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 280481 Р 1) 3301597/28-13М. Кд,з С 12 й 9/02 с присоединением заявки йо, (23) Приоритет Государственный комитет СССР яо делам изобретений и открытийДата опубликование описания 07.12 В 2 72) Авторыизобретения(54) СПОСОБ ВЦДЕЛЕНПЯ 2 п, Сц-ЗАВИСИМОЙСУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ ИЗ ПЕЧЕНИКРЕББС ЬЕ 2 Н-НО + 01,атации суперреакцию спонтанно оксида.Известно, что супероксидцисмута металлы. Так, в крысы найдено два дисмутаз: 2 п, Сцзольной Фракции) митохондриях),ный центр т многиепеченисупероксидая (в цитовисимая (в активходеткахипависимМп-з Изобретение относится к химической энэимологии и может быть использовано в медицинской промышленности и в лабораторной практике для получения фермента 2 п Сц-зависимой суперокаидцисмутаэы (1.15.1.1) иэ печени крысы, которая может найти прн" менение в различных отраслях народного хозяйства.Супероксиддисмутаза может найти применение для защиты.от проникающей радиации, от токсичности высоко-. го уровня кислорода в газовой смеси для дыхания, в качестве антимутагенного фактора, в онкологии, геронтологии, пищевой промышленности,Фермент специфичен к субстрату О и катализирует следующую реакцию: Известен способ выделения 2 п, Сизависимой супероксиддисмутазы изпечени.крлсы включающий гомогениэирование сырья в экстрагирующемрастворе, центрифугированием при13000 о для отделения супернатйнтаобработку сунернатаита, содержащегоМп-зависимую и 2 п Сц- зависимуюсупероксиддисмутазы, смесью этанолхлороформ (0,25 Н:0,15 Н) для уничтожения Мп-зависймой локалиэуюцейсяв митохондриях супероксиддисмутазыс последующим центрифугированиемсмеси при 13000 01.В полученный раствор добавляютКНРО 4. ДЛЯ .ВЫСаЛИВаиия примЕсЕй, осадок отделяют и осаждают иэ надосадочной жидкости белки ацетоном (2 Н),Ацетоновый осадок растворяют в К-фос. фатном буфере (рН 7,8) и диализуютв течение 15 ч. Затем проводят хромтографкю при рН 7,8 на колонке,заполненной сефадексом С. фракции,.содержащие супероксиддисмутазудиализуют и разделяют с помощьюионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе с элюцией линейным градиентом МаС 1 от 0-0,2 М. Активныефракции концентрируют на мембране ЗО Авсоп ОМдо содержания 3-5 мгНаименованиеиспользуемыхреактивов Степень чистоты Длительностьфракционирования, г Способ выделения и очистки Количество стадий Известный а) этанолб) хлороформв) ацетон Около80 ч 3 97950 белка/мл. При использовании этого метода степень частоты равна 118, а длительность Фракционирования составляет примерно 80 ч 1,1.Такая многоступенчатая очистка приводит к частичной денатурации Фермента, во-первых, за счет применения органических растворителей и, во-вторых, из-за длительности процедуры фракционирования.Однако данный способ характери- О зуется недостаточно высокой степенью чистоты целевого продукта и сложностью процесса выделения.Цель изобретения - повышение степени чистоты фермента СОД и упроще ние способа его выделения.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения Еп, Си-зависимой супероксиддисмута-, зы из печени крысы, заключающимися э 0 в гомогенизировании сырья и экстракции фермента, удалении Ип-зависимой супероксиддисмутазы и осаждении выделяемого фермента ацетоном с последующей хроматографией на полисахаридном сорбенте при рН 7,8 с элюцией буфером, содержащим йаС 1, удаление Мпзависимой супероксиддисмутазы осуществляют. центрифугированием гомогената при 105-110000 9, ацетон для осаждения Еп, Со-зависимой супероксиддисмутазы из полученной после высокоскоростного центрифугирования цитозольной фракции используют в объемном соотношении 1:(1,5-1,7), а хроматографию проводят на диэтиламиноэтил-сефадексе, с элюцией ступенчатым градиентом ИаС 1 0,05-0,1 М, причем стадию хроматографии проводят дважды.Предлагаемый способ позволяет 40 повысить степень очистки до 250 раз, сократить длительность процесса выделения на 20 ч и значительно упростить сам процесс.П р и м е р. Охлажденную печень 45 крыс гомогенизируют при ОфС в растворе, содержащем 0,25 М сахарозы, 1 мм ЭДТА, рН 7,4, из расчета нб 1 г ткани 10 мл раствора. Гомогенат центрифугируют при 105000 9 в течение 60 мин. К надосадочной жидкости (цитозольной Фракции) добавляют при перемешивании 1,5 объема охлажденного ацетона и полученный осадок отделяют центрифугироваиием в течение 20 мин при 1000 9. Затем осажденную ацетоном Фракцию суспендируют в минимальном объеме 5 мМ Фосфатного буфера, рН 7,8 и диализуют5 ч против 100 объемов этого же буФера. Дальнейшую очистку проводят на колонке размером 400 25 мм, запол ненной ДЭАЭ-сефадексом Аи уравновешенной 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,8.Белки сорбируют при пропускании через колонку 5 мм Фосфатного буфера, рН 7,8, а затем элюируют, используя ступенчатый градиент хлорида натрия: первоначально промывают колонку 5 мМ фосфатным буфером, рН 7,8, содержащим 0,05 М МаС 1, а затем этот буфер заменяют на 5 мМ фосфатный буфер, рН 7,8, содержащий 0,1 М КаС 1, Фракции с максимальной активностью энзима собирают и диализуют против 5 мМ фосфатного буфера, рН 7,8 в течение 3 ч. Затем рехроматографируют их на колонке размером 150 ф 10 мм, заполненной ДЭАЭ-сефадексом А. Сорбцию и элюцию проводят при тех же условиях: энзиматически активные Фракции "выходят" при вымывании белка 0,1 М НаС 1.При таком способе выделения степень чистоты Фермента составляет 250, а продолжительность фракционирования около 60 ч.Конечную чистоту препарата определяют методом электрофореза в 7-ном полиакриламидном геле (электрофоретическое разделениепроводят в трисглициновом буфере, рН 8,3, при силе тока 5 мА на один столбик геля, продолжительность процедуры 2,5 ч). Для выявления зон, содержащих активность СОД, гели окрашивают специфическими для данного фермента реактивами. В результате всем полученнымбелковым зонам при окрашивании амидовым черным соответствуют зоны активности СОД.Удельная активность гомогенного препарата (45 й 3) 000 ед/мг.В таблице приводятся сравнительные данные известного и предлагаемого способов выделения и очистки Фермента СОД из цитозола печени крыс.,Продолжение таблицы г) сефадекс фф 75 д) ДЭАЭ- целлюлоза Предлагае- мый а) ацетон Около60 ч б) ДЭАЭ- сефадекс А250 Формула изобретения Составитель О. СкородумоваРедактор А. Гулько Техред С.Мигунова Корректор М.Демчик Заказ 9282/9 Тираж 505 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, Б, Раушская наб., д. 4/5Подписное Филиал ППП "Патент , г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Технико-зкономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет сравнительно быстро. получать фермент СОД с большей степенью чистоты в нативном состоянии беэ значительного ингибирования его активности. Способ может быть использован в промыл- ленных целях для получения СОД. Способ выделения Уп Са-зависимой супероксиддиамутазы из печени крысы, включающий гомогенизирование сырья и экстракцию фермента, удаление Ип-зависимой супероксиддисмутазы, осаждение выделяемого фермента ацетоном с последующей хроматографией. на полисахаридиом сорбенте при,рЩ;7 ф с элюцией буфером, со держащй а 01, о т л и ч а ю щ и йс я теи, что, с целью повышениястепени чистоты целевого продуктаи упрощения процесса, удаление Ипэависимой суперсксивдисмутазы осуществляют центрифугированием гсмогената при 105-110000 9 ацетеи дляосаждения Еп, Си-зависимой супероксиддисмутазы из полученной цитозольной фракции используют в объемномсоотношении 1:(1,5-17) хроматографию проводят на диэтиламиноэтилЗО сефадексе с элюцией ступенчатых градиентом МаС 1 от 0,05 до 0,1 М, причем хроматографию проводят дважды.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе35 1. Ке 1 ьв О, СегьЬоп О, Рай 11 чегьцрегок 1 де,дТявцйаяе, Рцг 1 Г 1 сай 1 опапд а 9 е-ге 1 агед щод 1 Г 1 са 1 опаРог. 1. В 1 осЬещ 1976, чо 1. 63,617-623.