Способ получения тромболитических ферментов специфичных к фибрину

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскикСоциалистическиеРеспублик и 973615ао делам нзобретеннй н отнрмтнйОпубликовано 15,11,82. Бюллетень42 Дата опубликования описания 15 11,82(72) Авторы изобретения Н. С. Егоров, Н. С. Ландау и И. И Милованова 1Московскии ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции.иорденаТрудового Красного Знамени государственный университетим. М. В. Лойоносова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ФИБРИНУ Изобретение относится к получению ферментных препаратов и может быть применено в медицине, микробиологической промышленности, гематологии и биохимии микроорганизмов.Известен способ получения протеаз фибрино.5 литического, казеинолитического и тромболитического действия путем совместного культивирования двух микроорганизмов одного рода, но разных видов: Аарегд 111 ца Еападаваепяя - продуцента протеаз и Аарегд 11 ца чцептП - неак тивного в отношении образования секретируемых протеаз организма, которые вносят в равных количествах в питательную среду: А.напав дашаеоаа - в виде посевного материала, а А, меод - в виде вегетативного материала, инкубируют, отделяют клетки и из культуральной жидкости выделяют целевой продукт 11.Недостатками способа являются необходимость получения для Аарегд 111 ца вептП не только двухсуточного посевного материала, щО иа трехсуточного вегетативного, что значитель. ло (иа 3 сут) удлиняет лроцесс получения целевого продукта (7 - 8 сут), кроме того, иевьсский выход целевого продукта и сниже. 2ние у целевого продукта специфичности к фибрину.Известен способ получения протеолитическихферментов казеинолитического и фибринолитического действия, предусматривающий совмет.оное культивирование при 28-30 С микроорганизма - продуцента и микроорганизма - стимулятора, не синтезирующего протеаз, последующее отделение клеток и высаливание целевого продукта сернокислым аммонием принасыщении 0,6 - Ол 8, в котором в качествепродуцента используют Астпотусеа гипозца,в качестве микроорганизма - стимулятораАстповусев чо 1 асеца, а посевной материалобоих штаммов вносят в среду в соотношении0,25:1 соответственно (2,Недостатками способа (прототипа) являютсядлительность способа (6 сут), многокомпонентность состава среды и наличие в ней дефицитныхи дорогостоящих реактивов, невысокий выходцелевого продукта (фибринолитическая активность 1901 ед/мл, казеинолитическая активность56 ед/мл), а также низкая специфичность кфибрину у целевого продукта (33,9).4ем на 28,8, фибринолитическим действием на 80% и тромболитическим действием на 50% больше, чем в чистой культуре Иосагйа яре - с 1 ея штамм 1. Увеличение ферментативной активности сопровождается возрастанием специфичности ферментов к фибрину (в 7 раз по сравнению с прототипом) .П р и м е р 2. В известную синтетическую среду СР - 1 (состав среды приведен) после стерилизации вносят 5% по объему жидкого двухсуточного посевного материала Иосагда яресея штамм 1 и 1,25% по объему жидкого двухсуточного посевного материала АгтЬго - Ьастег с 1 тгеця штамм В - 654, выращенного на среде МПБ+3% глюкозы, Культивирование смешанной культуры осуществляют глубинным способом в колбах на 750 мл со 100 мл среды на качалках(280 об/мин) при 30 С в течение 70 ч. По истечении этого временикультуральная жидкость содержит3280 усл, ед/мл фибринолитической активности, 14,1 каз, ед/мл казеинолитическойактивности и растворяет тромбы за 1,6 ч.Для вьщеления фермента клетки отделяют откультуральной. жидкости центрифугированиеми проводят высаливание ферментов сернокислым аммонием при насыщении 0,8 в течение 48 ч при 4 С. Выпавший осадок растворяют в воде, диализуют 24 ч при 4 С против 0,002 М ацетата кальция и лиофильно высушивают, Полученный препарат обладает специфичной активностью в 16450 ед/мг белка.В таблице представлена сравнительная ха. рактеристика ферментных препаратов, получен; способу, Поскольку в совместной культуре казеинолиз возрастает всего на 28,8%, фибринолиз на80%,то резко (2 - 7 раз) увеличивается спе.цифичность получаемых протеаз к фибрину,Наличие у целевого продукта высокойспецифичности к фибрину имеет большое прак. тическое значение, так как именно это свой.ство обеспечивает при. действии фермента1 и ачо возможность растворять тромбы крови ков крови, т, е. без гемофилии, которая представляет такую же опасность для жизни человека как и тормбоз,Таким образом, реализация изобретения продуцента, увеличить фибринолитическую активность и повысить специфичность целевогопродукта к фибрину,3 973615Цель изобретения - ускорение процесса куль.тивирования, увеличение фибринолитической активности и повышение специфичности фермент.ного препарата к фибрину.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тромболитическихферментов специфичных к фибрину, предусматри.вающему совместное культивирование при 28 -30 С микроорганизма - продуцента и микроор.ганиэма - стимулятора, не синтезирующего 10протеаз, последующее отделение клеток и выса.ливание целевого продукта сернокислым аммонием при насыщении 0,6 - 0,8, в качестве продуцента используют Иосагйа яресея, штамм 1, вкачестве микроорганизма - стимулятора Арго Ьастег стгеця, штамм В - 654, посевной материал обоих штаммов вносят в питательную средув соотношении 1:0,5 - 1; 0,25 соответственно,а культивирование осуществляют в течение 70 -72 ч. гоШтамм В - 654 АгтпгоЬастег сйгеця хранится, под этим номером во всесоюзной коллекциимикроорганизмов АН СССР (Институт физиологии и биохимии микроорганизмов АН СССР).П р и м е р 1. В известную синтетическунИ 5среду СР - 1 (глюкоза 2%, КИОэ 0,1%, КНР 040,005%, Мд 5040,05% ИаС 1 0,05%, СаСОз 0,1%,Ре 504 0,001%)после стерилизации вносят 5% пообъему жидкогодвухсуточного посевного материала Иосагйа яреоея штамм 1 и 2,5% по 50объему жидкого двухсуточного посевного, материала АгтпгоЬастег сНгеця штамм В - 654, выращенного на среде МПБ+3% глюкозы. Культи.вирование смешанной культуры осуществляютглубинным способом в колбах на 750 мл ных по способу прототипу и предлагаемомуосо 100 мл среды на качалках (220 об/мин) при28 С в течение 72 ч. По истечении этого времени культуральиая жидкость содержит3456 усл, ед/мл фибринолитической активности,14,3 каз, ед/мл казеинолитической активйостии растворяет тромбы за 1,5 ч, Для выделенияфермента клетки отделяют от культуральнойжидкости центрифугированием и проводятвысаливание ферментов сернокислым аммониемпри насыщении 0,6 в течение 48 ч при 4 С.Выпавший осадок растворяют в воде, циализу. без гидролиза других жизненно важных белют 24 ч при 4" С против 0,002 М ацетата каль.ция и лиофильно высушивают. Выделенныйпрепарат обладает специфичной активностьюв 16500 ед/мг белка.50Полученные результаты свидетельствуют о позволяет сократить время культивированиятом, что в смешанной культуре микроорганизмов по предлагаемому способу происходит об.разование протеаз с казеинолитическим действи973615 Фибринолити.ческая активность, Ф Казеннолнти. Тромболнтнческая актив.ность Специфич. ность к фибрионуФ/К Вариант опыта ческая активность, К усл.ед. % каэ.ед. % времяполного мл лизиса,ч, ОпытМосагйа ресе/АгЮгоЬастег стгеиВ 654 3456 , 180 14,3 128,8 1,5 50 241,7 Состзвнтель И. ПриваловаТехред Е,Харитончик Редактор И. Митровка Корректор У. ПономаренкоПодписное Заказ 8617/29 Тираж 505ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий1 13035, Москва, Ж.35, Раушская наб д, 4/5 Филизл ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Формула изобретения Способ получения тромболитических фермен тов, специфичных к фибрину, предусматривающий совместное культивирование при 28 - 30 С микрооргзнизма продуцента и микрооргзниэма - стимулятора, не синтезирующего протеаз, последующее отделение клеток и высзливание целевого продукта сернокнслым аммонием при насыщении 0,6-0,8, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения процесса культивирования, увеличения фибринолитической активности и повышения специфичности фер. зф ментного препарата к фибрину, в качестве продуцента используют Йосагйа ресез, штзмм 1, в качестве микроорганизма - стимулятора АгФгоЬастег стгец, штамм В - 654, посевной . материзл обоих штаммов вносят в питатель. ную среду в соотношении 1:0,5 - 1:0,25, соответственно, з культивирование осуществляют в течение 70 - 72 ч. Источники информации,принятые во внимание нри экспертизе1. Авторское свидетельство СССР Яф 605826,кл, С 12 К 9/68, 1978,2. Авторское свидетельство СССР йф 436086,кл, С 12 й 9/48, 1972 (прототип).