Способ определения изоферментов креатинфосфокиназы в тканях

957105 ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Сфез СоветскиСоциалистическиРеспублик(22) Заявлено 15.08.80 (21) 297 1166/28-13с присоединением заявкирстюей каетвтСССРмам звбрвтевкйи отрмтй 23) Приори 3) УДК 616 07(088. 8) убликовано 07,09.82, БюллетеньЗЗ,ата опубликования описания 09,09.82 72) Авторы изобретени това, Т. С. Сем аС. ЯКиров ьковский медицинский ннст аявит(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОФ КРЕАТИНФОСФОКИНАЗЫ МЕНТО КАНЯХ Изобретение относится к биохимии, в частности к определению изоферментов среатинфосфокиназьт в тканях, предпочтительно в сердце и мозге. Известен способ определения изофер 5ментов креатинфосфокинаэы в тканяхпутем экстракции креатннфосфокинаэы изобразца с последующим электрофоретическнм разделением экстракта, при этомэкстракт наносят на ацетатцеллюлоэныйноситель. Этот способ предусматриваетнасыщение ацетнлцеллюлозного носителяэлектродным трис-вероналовым буфером(рН 8,8) с добавлением тиолредуцирующего агента, нанесение на носитель. образца исследуемой ткани проведение электрофореза, идентификацию среды глнцилглицинового буфера (рН 7,2), креатинфосфата, АДФ, АМФ, НАДФ, гексокиназы, 20глюкозо-фосфатдегндрогеназы фенозинметасульфата, нитросинего тетразолия,ионов магния с последующим денситомет- рированнем 1. Н. Балакина и И. Н. БалиринаНоситель замачнвают в трио-вероналовый буфер (рН 8,8) с добавлением в качестве тиолредуцнрующего . ецта дитиатрейтола, Электрофореэ проводят в течение 45 мин при 15 оС .и градиенте потенциала 250 В/см. Затем электрофорвэные ленты располагают на стеклянной пластине и сверху на них наклодывают другие ацетатцеллюлозные ленты, выдержанные предварительно 10 мин в инкубационной смеси (для приготовления инкубационной смеси к 15,мл 0,05 М глицил-глицинового буфера (рН 7,2) прибавляют 0,11 мМ глюкозы, 0,15 мМ АДФ, 5,2 мМ НАДФ, ЗЗ мМ креатиаосфата, 10 мл (160 ед. Бюхера) гексокиназы, 10 мл (80 ед. Бюхера) глюкозо- -фосфатдегндрогеназы. Далее на каждую пару лент накладывают ленты, выдержанные 10 мнн в темноте в индикаторной смеси (для получения индикаторной смеси готовят раствор фаэозннметосульфата (1 мгlмл), хранят при -10 оС, затем готовят раствор тетразолия питрого;убого105 4Нктросиний тетразолий,мМ 0,31-0,61Хлористый магний, мМ 10,0-31,6Способ осуществляется следующим об разом.Полоски ацетатцеллюлозной пленки"Владипор" замачивают на 10-15 мин вэлектродный тряс-вероналовый буфетрН 8,8), содержащий 10 мл глутатио на, Затем избыток влаги удаляют фильтровальной бумагой. Полоски помещают вкамеру для электрофореза, натягивают их,к включают напряжение на 10 мин. Затем ток выключают и наносят образцы 5 исследуемой ткани. Проводят электрофоретическое разделение в режиме, определяемом видом исследуемой ткани.Для проведения креатинфосфокиназнойреакции, используемой для идентификации 20 изоферментов,. полоски ацетатцеллюлоэыпредварктельно пропитывают 10 мин инкубационной смесью следующего состава:глицил-глициновый буфер 10 мл (рН 7,2);креатинфосфат 40 мг; АДФ 6 мг; АМФ 25 50 мг; НАДФ 3 мг; гексокнпаза 0,2 мг;глюкозо-фосфатдегидрогеназа 10 ед.;фенозинметалсульфат 2 мг; нитросиний тет.разолий 3 мг; М(С 130 мг.Затем полоски плотно накладывают на 50 полоски с образцами тканей, вынутые кэкамеры для электрофореза. Такие двойные . полоски инкубируют в термостате при37 ОС 10 мин. Проявленные полоскиосветляют вазелиновым маслом и десито метрируют.Предложенным способом проведено 25опытов с электрофоретическим разделениемизоферментов креантинфосфокинаэы втканях сердца и мозга. Во всех случаяхпредлагаемый способ позволил получить4 фракции:иэ сердца - ММ МВ, ВВ имитохондриальную фракцию и 2 фракциииз ткани мозга - ВВ и митохондриальную. 0,65-098 3 087 для чу 27 мг тетраэолия нктроголубого и 2 мМ М(ОАс) 4 Н 10 в 100 мл глкцилглицинового буфера (рН 7,2) фильтруют и хранят при 8 оС, непосредственно перед опытом 0,4 мл раствора фенозин метасульфата смешивают с 10 мл раствора тетразолия голубого) к инкубируют 1 ч при 37 о С. Окрашенные пятна денситометрируют 1.Недостатком известного способа являвтся малодоступность носителя, а также дитиотрейтола, используемого в качестве тиолредуцирующего агента. Кроме того, известный способ длителвн, так как про.должительность анализа 3 ч, в частности много времени занимает идентификация вследствие того, что ннкубацию проводят дважды (по 1 ч каждый раэ).Кроме того, известный способ имеет недостаточную разрешающую ппособностьтак как в исследуемых образцах он позволяет обнаружить только 3 кэофермента КК. Целью изобретения является ускорение способа.Указанная цель достигается тем, чтосогласно способу определения изоферментов креатинфосфокинаэы в тканях путемэкстракции креатинфосфокиназы иэ образца с последующим электрофореткческимразделением экстракта, при этом экстрактнаносят на ацетатцеллюлозный .носитель,предварительно насыщенный буфером сдобавлением тиолредуцирующего агента,полученную электрофорограмму инкубируют в среде, содержащей глицил-глициновый буфер с РН 72, креатинфосфат,АДФ, АМФ, НАДФ, гексоккназу, глюкозу,глюкозо-б-фосфатдигидрогеназу, фенозинметасульфат, нитросиний тетраэолий, хло-.ристый магний с последующей денситометрией окрашенных участков форограммы,в качестве носителя используют пленку"Владипор", в качвстве тиолредуцирующего агента - гаютатион инкубируют втечение 6-14 мин, а компоненты инкубационной среды взяты в следующих количествах:Крваткнфосфат, мМ 11,0-33,0АДФ, мМ, 1,1-1,5ЛМФ мМ 11,0-13,0НАДФ, мМ 0,37-082Глюкоза мМ 7,0-20,01 ексокиназа МЕ 5-7Глюк оэо-фосфатдегидрогенаэа, МЕ 5-7Фенозинметасульфат,мИ П р и м е р 1. Применение предлагаемого способа для разделения иэофермен тов креатинфосфокиназы в сердечной мышоце.Полоски ацетатцеллюлозной пленки 50Владипор" М 5 на 10 мин замачиваютв электродный тряс-вероналовый буфер,содержащий 10 мл глутатиона. Затем помещают в камеру для электрофореза, натягивают их, включают рабочее напряжениена 10 мин. Ток выключают и наносят 55образец ткани - экстракт сердечноймышцы, электрофорез проводят при напряжении 200 В 70 мин. Затем полоскис образцом ткани вынимают кз камеры0,31-0,61 10,0-31,6 5 9571для эдектрофореза и накладывают на нихполоски ацетатцеллюлозы, предварительно пропитанные инкубационной смесью.Двойные полоски инкубируют в термостате при 37 оС 10 мин, затем осветляютвазелиновым маслом и денситометрируют.Предлагаемый способ позволяет выделитьиз сердца 4 фракции изоферментов КК,ММ, МВ, ВВ и митохондривльную фракОциюеП р и м е р 2, Разделение изоферментов креатинфосфокиназы в ткани мозга,Полоски ацетатцеллюлозной пленки"Владипор" % 5 на 10 мин замачивают1%в электродный трис-вероналовый буфер,содержащий 10 мл глутатиона, затем помешают в камеру для электрофореза, натягивают их и на 10 мин включают рабочее напряжение, Затем ток выключаюти наносят экстракт ткани мозга. Электрофорез проводят при напряжении 130 В70 мин. Потом полоски с образцом тканивынимают из камеры для электрофорезаи накладывают на них полоски ацетатцел- ф23люлозы, предварительно пропитанные инкубационной смесью, и инкубируют при37 оС 10 мин. Проявленные полоскиосветляют ваэелиновым маслом и денситометрируют. Получают 2 фракции изофер ментов,КК, ВВ и митохондриальную, которые по данным литературы характерныдля креатинфосфокиназы мозга.Предлагаемый способ обеспечивает посравнению с известным ускорение процес- уса, при этом анализ занимает 90100 мин, а в известном - 180 мин.Предлагаемый способ обеспечиваетсокращение времени идентификации изоферментов с использованием предлагае пмой инкубационной смеси с 2-х ч до10 мин по сравнению с известным.Предлагаемый способ позволяет повысить разрешаюшую способность и выделить из ткани сердечной мышцы 4 изо- ,цфермента, тогда как по известному способу 3 изофермента,Предлагаемый способ доступен засчет использования в качестве носителявцетат-целлюлозной пленки "Владипор"М 4 и 5 и в качестве тиолредуцируюшего агента электродного, буфера вместо 05 6труднодоступного дитиотрейтола по известному способуПредлагаемый способ не требует для приготовления инкубационной смеси больших количеств редких реактивов. формула изобретения Способ определения изоферментовкреатинфосфокиназы в тканях путем экстракции крватинфосфокиназы из образца с последующим электрофоретическимразделением экстракта, при этом экстрактнаносят на ацетатцеллюлозный носитель,предварительно насыщенный буфером сдобавлением тиолредуцирующего агента,полученную электрофорограмму инкубируют в среде, содержащей глицил-глициновый буфер с рН 7,2, креатинфосфат, АДф,АМф, НАДф, гексокиназу, глюкозу, глюкозо-б-фосфатдигидрогеназу, фенозинмета"сульфат, нитросиний тетразоний, хлористый магний с последующей денситометрией окрашенных участков форограммы, фо т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью ускорения способа, в качестве носителя используют пленку "Владипор", вкачестве тиолредуцирующего агента -глютатион, инкубируют в течение 614 мйн, а компоненты инкубационнойсреды взяты в следующих количествах:Креатинфосфат, мМ 11,0-33,0АДф, мМ 1, 1-1,5АМФ, мМ 11,0-13,0НАДф, мМ 0,37-0,82Глюкоза, мМ 7-20Гексокиназа, МЕ 5-7Глюк озо-фосфатдегидрогеназа, МЕ 5-7фенозинметасульфат, мМ 0,65-0,98Нитросиний тетразолий,мМХлористый магний, мМ Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Тга 1 пег Тпоааэ О., Сгаепц Оач 1 д. Агар 0 аеййод аког йЬе апа 1 уы эоГ сгеай 1 пе рЬоэрпоМпазе 1 эоепуаеэ":С 11 п. СЬа. аса, 1968, 21, 1 г 1,р. 151-14, ВНИИПИ Заказ 6589/32 Тираж 887 Подписноефилиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 1