Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов

Союз СоветскихСоциалистическихРесттубпик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 907434(5м. Кл.6 О 1 И 33/48 С 01 И 33/52 с прнсоелинением заявки Рй ЪеудяРстаеииъЮ камитет СССР дв делам изобретении и открытии(23) П риоритет Опубликовано 23.02.82. Бюллетень ЛЪ 7 Дата опубликования описания 25. 02. 82(72) Авторы изобретения Б. А. Ломсадзе, Ю, А. Владимиров, М. А. Царцидзе, О. С, Джишкариани и М. П, Мардалейшвили Тбилисский ордена Трудового Красного Знамени1государственный университет(,54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО КОЛИЧЕСТВА ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ Изобретение относится к биохимии и химии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипи- дов в крови, в органах животных, например, печени, а также в опухоли,Известен способ определения коли 5 цества фосфолипидов, включающих выделение фосфолипидов из крови, растворение их, добавлсние к раствору фосФолипидов водного раствора красителя0 оранжевого кислотного, смесь разделяют отстаиванием в делительной воронке и определение количества Фосфолипидов по количеству перешедшего в органическую фазу красителя 1 1. Недостатками этого способа являют,ся большая трудоемкость. Раствор красителя вносят в мицеллу в несколько приемов, а смесь отделяют отстаиванием после внесения каждой пробы и продолжительность процесса определения (30-60 мин), а также невозможность определения суммарного колицества отрицательно заряженных фосфолипидов,Цель изобретения - разработка способа определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов и повышение тоцности определения.Поставленная цель достигается тем,цто для растворения фосфолипидовиспользуют четыреххлористый углерод,а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридиновогооранжевого 3,2 1 О -6 1 О тМ концентрации, причем степень распределениякрасителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивностипоглощения красителя в водной и органицеской Фазе.П р и м е р. Липиды экстрагировали 20-ти кратным объемом смеси хлороформметанопа 2:1, два раза смесью(,1:1) и затем осадок заливали этойже смесью (1:11 и оставляли на ночь.На следующий день экстракция пипилояЭО проводилась еще дважды смесью хлороФормметанола (2:1),Объединенные липидные экстрактыотмывали от водорастворимых примесей охлажденным раствором 0,3 Н ИаС 1добавляемым с таким расцетом, цтобыверхний водный слой содержал не более 503 спирта (дабы он не извлекалфосфолипиды).После центрифугирования верхнийводорастворимый слой отсасывался,Пленка, образующаяся на поверхностираздела двух фаз (хлороформенный иводно-спиртовый) растворялась добавлением небольшого количества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды упаривали под вакуумом досуха при комнатной температуре, Общее количестволипидов определяли весовым методом,сухой остаток растворяли в органицеском растворителе - четыреххлористом углероде - СС 14, из расчета,чтобы в 1 мл раствора содержалось2 мг липида.Процесс выделения липидов и определения их в них суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов проводили при стандартных условиях (комнатная температура - 1820 С, давление - 760 мм рт. ст ,)оК фосфолипидам, растворенным вСС 1 добавляют водный раствор акридинового оранжевого, разделяют органическую и водную фазы отстаиванием вделительной воронке и измеряют интенсивность поглощения красителя в органической и в водной фазах. Вычисляют коэффициент распределения красителя между двумя фазами и опредеПолученное количествофосфатидилинозита, мкг Ошибка опыта, Ф Наименование способа 1 т 7 Таблица 2 Ошибка опыта, Ф Полученное количествофосфатидилинозита, мкг 3,2 10 104,2 116 118 115 б .10 Тонкослойная хроматография Способ определения отрицательно заряженныхФосфолипидов Концентрация акридиновогооранжевого, .моль 7434 4ляют количество отрицательно заряженных фосфолипидов по стандартной кривой, Стандартная кривая строится поизвестным концентрациям фосфолипидов.Коэффициент распределения красителя между двумя фазами определяют поФормуле1(,31 О "наФл 3где ВСС - оптическая плотность крафсителя в органической35фазе;- оптическая плотность красителя в водной фазе;Ф Л - концентрация фосфолипидов.Продолжительность процесса определения 5-10 мин при 18-20 С.Сравнительные данные определениязаданного (например, 120 мкг) количества отрицательного заряженногофосфатидилинозита с помощью предла 25гаемого и известного способами приведены в табл,1.Данные осуществления способа определения заданного ( например, 120 мкг,)количества отрицательно заряженногофосфатидилинозита при границных исреднем значениях концентраций водного раствора красителя приведены втабл. 2.Использование предлагаемого способ ба определения отрицательно заряженных фосфолипидов обеспечивает быстроту и простоту определения, а такжеболее высокую точность анализа всравнении с известными способами,Т а б л и ц а 1.Способ определения суммарного количества отрицательно заряженных фосфолипидов, включающий выделение фосфолипидов из крови, Растворение их, добавление водного раствора красителя, разделение органической и водной фаз в делительной воронке и определение количества отрицательнозаряженных фосфолипидов по степени распределения красителя между двумя фазами, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности опре деления, для растворенияфосфолипидов используют цетыреххлористый углерод, а в качестве раствора красителя используют водный раствор акридинового оранжевого 3,2)10 "- б 10М концентрации, причем степень распределения красителя между двумя фазами определяют путем измерения интенсивности поглощения красителя в водной и органической фазе.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССР й 412548, кл. С О 1 И 33/02) 06.03.72.Составитель Л. РубиноваРецактор А. Ванно Техреду Е, Харитончик Корректор М. ПожоЗаказ 581/52 Тираж 883 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпр делам изобретений и открытий113035 Москва, Ж, Раушская наб. 6. 4/Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4