Способ получения стабилизированных ферментов, содержащих sн группы

Союз СоветскниСоциалистическихРеспублик ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИяК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 8831 6ио делзн изабретеиий и открытий(53) УДК 577.15.07(088.8) Дата опубликования описания 23. 11, 8 1 Березин, М. М. Диков, А. М. Его Ю, Карулин, М. И. Мустафаев и А И.(7) Заявитель нина и ордена Тру ный университет им осковскии орденанамени государств 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ ФЕРМЕНТ СОДЕРЖАЩИХ 5 Н-ГРУППЫк энзимоло - получения стакоторые могутмер, в проточ -ен группамиферментза катал о типа, в автобиологических цируется тивности или 5 НКромевать вели е фер - со- тоидина деленном д падает с о величиной,Цель из ние ак чаемых ретения - потабильности тивности истабилизиро ермента- по ент н Поставленная цель стигается согющемуся в обастворимым поли Хне пиридина, виным поли-ви.Iответствующемой точки ферКубст- вании Изобретение относитсягии, а именно к способамбилизованных ферментов,быть использованы, наприных реакторах мембранногматических анализаторахобъектов и т, д.Известен способ получения стабзированных ферментов, содержащихгруппы, заключающийся в обработкмента водорастворимым полимеромполимером акролеина и 4-винилпирв присутствии кофакторов или субстов. Процесс проводят при рН 7,5.Полученные стабилизированные фты сохраняют до 903 активности, сбильность возрастает в 20-90 разсравнению с нативным ферментом 1Недостатками способа являютсявысокие значения активности и станости получаемых ферментных комплсов; проведение реакции в присутсбольших количеств кофактора или срата фермента, так как при образо х связеи между альдегиднымиолимера и активными группамй часть из них, ответственная тическую активность, модифи что приводит к снижению ак фермента. о, необходимость поддержину рН в очень узком опрепазоне 75 не всегда совимальной для активности ласно способу, заключа работке фермента водор мером на основе 4-винил частности, кватернизов нилпиридином при рН, со значению изоэлектричес мента.3 88311Предпочтительно процесс ведут примольном соотношении фермент: полимер(1-20) ; .Существенными отличиями способаявляются;использование в качестве водорастворимого полимера на основе 4-винилпиридина кватерниэованного поли-винилпиридина и проведение процесса при рН, соответствующем изоэлектрической точке фермента.1 ОСпособ осуществляется следующим образом,Проведение процесса при рН, соответствующем изоэлектрической точкефермента, связано с тем, что стабилизация происходит за счет образованияэлектростатического комплекса ферментполимер.Наблюдаемый эффект стабилизацииобусловлен тем, что при комплексообразовании молекула полимера как бы"опутывает" молекулу фермента, в результате чего вокруг молекулы фермента образуется положительно заряженнаяоболочка, препятствующая проникновениюк молекуле белка ионов металлов, являющихся катализаторами окисления существенных для активности БН-группфермента, растворенным молекулярнымкислородом. Наличие в молекулах полиЭОмера, описанного в известном способеальдегидных групп приводит помимоэлектростатического взаимодействия сФЕрментом, к образованию ковалентныхсвязей между альдегидными группаминосителя и ЙН-группами (возможно такЭЭже 5 Н в группа) фермента, что вызываетснижение его начальной активности ибыструю потерю активности на начальной стадии инактивации. Так как используемый в предлагаемом способе полимер не содержит альдегидных групп(в отличие от используемого известного полимера), то модификации ферментане происходит, и процесс комплексообразования не сопровождается потерейактивности. Кроме того, общий положительный заряд полимерной молекулыбез альдегидных групп с тем же молекулярным весом значительно больше, аследовательно, эффект экранирования Ффбелковой глобулы заряженным полимеромвыше, чем в известном способе - в слу.чае полимера с альдегиднымигруппами.Это обуславливает увеличение активности и масштаба стабилизации фермен- ,Ятов поли-ч-винилпиридином по сравнению с полимером, описанным в известном способе,76 4Образующийся электростатическийкомплекс фермента является прочным ине разрушается при высокой ионной силе раствора,Описываемый способ получения стабилизированных ферментов позволяетполностью сохранять начальную активность 5 Н-ферментов, а также более чемв 500 раз повысить их стабильность.При этом процесс протекает без добавления субстратов и кофакторов при рН,оптимальных для действия ферментов,Пример 1. К 2 мл 0,310 Мраствора формиатдегидрогеназы (мол. вес80000, уд. активность 10 ед/мг) в0,05 М Фосфатном буфере рН 7,2 приливают 2 мл 0,310 М раствора в томже буфере кватернизованного поли-винилпиридина ( степень. алкилирования1002, мол, в. 40000). Иммобилизованный фермент полностью сохраняет своюактивность. Стабильность комплекса,при 37 С, определяемая по кажущейсяконстанте инактивации первого порядка,по глубине превращения 507. возрастаетв 500 раз. Иммобилизованная формиатдегидрогеназа теряет 507 активности при37 С в течение 800 ч, время полной инактивации нативного Фермента 60 ч.Лучший показатель для Формиатдегидрогеназы, иммобилизованной по известному способу, полученный при проведении процесса в присутствии Формиата300 ч. Синтез и фракционирование поли- -винилпиридина проводят по методам, известным в литературе 21 и 31.Полимеризацию 4-винилпиридина осуществляют при перемешивании в толуоле,о не содержащем кислорода, при 50 С. Готовый продукт несколько раз промывают толуолом и бензолом и высушивают доо постоянного веса в вакууме при 40 С, Фракционирование поли-винилпиридина проводят пробным осаждением в системе четвертичный бутанол-бензол. Используют узкую Фракцию полимера. Кватернизацию поли-винилпиридина осуществляют бромистым этилом в метаноле при 60 С в запаянных ампулах под аргоном,Пример 2. К 2 мпЗфО М раствора формиатдегидрогеназы (мол. вес 80000, уд. активность 10 ед/мг) в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 приливают 2 мл 5 ф 10 М раствора в том же буфере кватернизованного поли-винилпиридина (степень алкили20 Формула изобретения Составитель О, СкородумоваРедактор Т. Киселева Техред Т. Маточка Корректор Г. Решетник Тираж 531 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 0124/37 Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4 5 8831рования 1002, мол. в. 900000). Активность фермента не изменяется,Полученный комплекс теряет приф37 С половину активности в течение1350 ч.Пример 3. К 2 мп 310 Мравствора апкогольдегидрогеназы иэ печени лошади (уд. активность 2 ед/мг)в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,8 приливают.2 мл З А 0 М раствора в том же вбуфере кватернизованного поли - 4-винилпиридина (1007 алкилирование,мол, вес 40000).Иммобилизованный фермент полностьюсохраняет свою активность,1Полученный комплекс теряет половину активности при 37 С в течение 600 ч3в то время как цативный фермент полно- .стью инактивируется эа 30 ч. 1, Способ получения стабилизированных ферментов, содержащих 5 Н-группы, 76 Ьобработкой фермента водорастворимымполимером на основе 4-вннилпиридина,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повьпдения активности и стабильности получаемого продукта, в качестве водорастворимого полимера используют кватернизованный поли-винилпиридин, при этом процесс ведут при значениях рН, соответствующих изоэлектрической точке фермента,2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что процесс ведут примольном соотношении фермент : Полимер(1-20) : 1,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Авторское свидетельство СССРУ 662557, кл. С 07 С 7/02, 1976(прототип).2. Опдцсйг, Епд СЬещ. 1950, 42,1603-606,3. б . Роупег, Ьс 1., 1956, 22,463-476.