Способ получения рибонуклеазы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК 9) 01)а) 4 А 61 К 35/60 ТЕНИ(54) ( АЗЫ п ыб к Е 12ститут биооргавосточного на,А.Рассказов88.8)РЬузо 1., 1972,5 ОСУДАРСТЭЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ САНИЕ ИЗ ТОРСНОМЪ( СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Тихоокеанский инической химии Дальнучного центра АН ССС(56) Сошр. В).осЬев.чоС. 41 В, рр. 263-27 57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛ утем экстрагирования печени р ислым водньи раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессоливанием и очистки, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве источника сырья используют печень минтая и очистку осуществляют на фосфоцеллюлозе и затем дополнительно рехроматографируют на том же сорбенте.8Изобретение относится к химикофармацевтической промышленностии касается производства ферментныхпрепаратов.Известен способ получения рибонуклеазы путем экстрагирования печени рыб кисльу водным раствором с последующим фракционированием экстракта сульфатом аммония обессоливаниеми очисткой.Однако известный способ.не обеспечивает высокого выхода рибонуклеазы,Известным способом получают 1,3 мгрибонуклеазы (по белку), что составляет 23 Х от активности сырого ферментного препарата. Очистка фермента достигнута в 96 раз,Цель изобретения - увеличениевыхода целевого продукта.Зта цель достигается тем, чтоспособ получения рибонуклеазы осуществляют путем экстрагирования печени рыб кислым водным раствором споследующим фракционированием экстракта сульфатом аммония, обессоливанием и очисткой, в качестве источника сырья используют печень минтаяи очистку осуществляют на фосфоцеллюлозе и затем дополнительно рехроматографируют на том же сорбенте.П р и м е р. 150 г свежемороженной печени минтая мелко измельчаюти экстрагируют кислым водным раствором (дистиллированная вода или физи-ологический раствор, подкисленныесерной кислотой до рН 2,5-3,0)(1 3 вес./объем) в скоростном электрогомогенизаторе, центрифугируют при8000 Я в течение 30 мин при 4 С.оСупернатант собирают, операцию повторяют еще раз для полного извлеченияфермента из ткани. К объединенномусупернатанту добавляют сульфат аммоония 30% насыщения при 20 С 1 перемешивают дб полного растворения соли иооставляют на 10-12 часов при 4 Сдля формирования осадка белка, фильтруют через двойной бумажный фильтрпри 4 С. Собранный осадок белка растворяют в минимальном объеме 0,05 Маммоний-ацетатного буфера, 0,002 МЗДТА, рН 5,3"5,4, обессоливают наколонке сефадекс Г, уравновешенной этим же буфером со скоростью220-240 мл/ч. Обессоленный сырой ферментный препарат адсорбируют на келонке с фосфо 13845 з 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 целлюлозой (1,5 45 см), уравновешенной 0,05 М аммоний-ацетатным.буфером0,002 М ЭДТА, рН 5,3-5,4, промываютколонку этим же буфером до исчезновения УФ-поглощения в элюате при А == 280 нм и элюируют фермент 0,01 Мфосфатным буфером 0,002 М ЭДТА,рН 7,1. Фракции, содержащие рибонуклеазную активность, объединяют, подкисляют 1 Е-ной уксусной кислотой дорН 5,5 и адсорбируют на колонке сфосфоцеллюлозой (объем колонки 2 мл),уравновешенной 0,05 М аммоний-ацетатным буфером, содержащим 0,002 МЗДТА, рН 5,5. Конечный целевой продукт элюируют медленной скоростью(6-8 мл(ч), 0,2 М фосфатным буфером,содержащим 0,002 М ЭДТА, рН 7,1. Наэтом этапе наряду с дополнительнойочисткой происходит концентрированиецелевого продукта.Из 150 г печени минтая получают0,9 мг рибонуклеазы (по белку), выход фермента по активности составляет 43,47, достигнута 278 - кратнаяочистка фермента.Исследование рибонуклеазы, получаемой по предлагаемому способу, показало, что:а) оптимум рН 5,5-5,8,об) температурный оптимум 37 С;в) фермент для проявления активности не требует двухвалентных катионов металлов и ЭДТА, двухвалентныекатионы металлов не ингибируют ферментативную активность;г) рН стабильность: 4,0-8,0;д) лиофильно высушенный препаратстабилен в течение 3-х месяцев при4 С.Данные процесса хроматографическойочистки кислой рибонуклеазы из печени минтая от стадии получения сырогоферментного препарата до выхода целевого продукта приведены в таблице.За единицу активности фермента принимали такое количество фермента, ко-торое за 20 мин инкубации при Т= 37 С приводит к образованию 1 ОЕспирторастворимых продуктов гидролиза субстрата. Предложенный способ позволяет увеличить выход рибонуклеазы по активности почти в 2 раза 43,47 по сравнению с выходом фермента, получаемого по известному способу, степень очистки по активности 278,3 раза, Способ непродолжителен во време813845 4очистки на фосфоцеллюлозе является электрофоретически гомогенным и не содержит других примесных ферментативных активностей (ДНКазной, фосфотазной. 4 осфодиэстеразной). ни, требуется 5-6 дней для получения целевого продукта. фермент после кислой экстракции из ткани, фракционного высаливания, обессоливанияи двухстадийной хроматографической Процедураочистки Степень очистки Общая энзиматическая акОбщийбелок,мг препарата. по активтивн ость ности Сырой ферментный 100 3456 576 2132 61,7 98,8 533 43,4 278,3 1670 1500 0,9 Техред И.Верес Корректор А.Зимокосов Редактор С.Титова Заказ 1628/4 Тираж 660 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная, 4 препарат (после фракционирования сульфатом а,ммония) 1 стадияхроматографическойочистки 2 стадияхроматографическойочистки Удельная активностьед/мг белка Выход фермента поактивности, Х