Способ определения стволовых лимфоидных клеток на гистологическом препарате

О П ИС"А.Г 4 Е ИЗОБРЕТЕНИЯ Союз Советских Социалистических Республик(51)М. Кл. 6 01 М 1/28 Госуаврствеииый комитет СССР ио деввм изобретеиий и открытий(71) Заявитель Научно-исследовательский институт морфологии человека АМН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТВОЛОВЫХ ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕИзобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для установления закономерностей .дифференцировки лимфоцитов, изучения механизмов их разви тия, возникновения лейкозов, иммунодефицитных состояний и разработки методов их лечения.Известен способ определения стволовых лимфоидных клеток на гистологическом препарате путем Фиксации в глютаровом альдегиде и четырехокиси осмия, заключения в смолы и электронно-микроскопического анализа 11.Однако известный способ не обес" 15. печивает высокой точности.Целью изобретения является повышение точности способа.Эта цель достигается тем, что ставят реакции на Т-антиген и ядерный 20 хроматин в лимфоцитах и при наличии в ядре клеток только диффузного хроматина определяют принадлежность кле" ток к стволовым лимфоидным.П р и м е р. Для работы исполь эуют 56 эмбрионов человека 7,5-8, 11-12 й 17-24 недель развития, полученных при медицинском аборте и преждевременных родах здоровых женщин, Под лупой выделяют тимус и разрезают 30 его пополам. Половину тимуса, иногда весь тимус или его часть Фиксируют 2,5 глютаральдегидом на Фосфатном буфере (рН 7,2)., содержащем 4,5 сахарозы. Другую часть тимуса или весь орган используют для приготовления клеточной суспензии. Кусочки тимуса, зафиксированные в глютаральдегиде в течение 1 ч при 0 С дополнительно фиксируют в 1 0504 , обезвоживают и заключают в зпонаралдитную смесь. Срезы получают на ультра- томе 1, КВ, контрастируют уранилацетатом и цитратом свинца и просматривают в электронном микроскопе 1 ЕМ 100 В. Полутонкие срезы окрашивают толуидиновым синим и исследуют под световым микроскопом.Суспензии клеток готовят путем мягкого раэдавливания ткани тимуса в стеклянном гомогенизаторе в охлажденной до 4 С среде 199 и процеживают через два слоя капроновой сетки. Большинство свободных клеток в суспенэии лимфоциты и 94-98 из них - живые по тесту с трипановым синим. Лимфоциты с поверхностными рецепторами к эритроцитам барана выявляются в реакции реэеткообраэования,. которую ставят по методу76 3737 Содержание клеток с компактнымхроматиномв ядре.,Содержание клеток, об разующих розетки с эритроцитами барана,одерание клеток, лизированных сывороткой против Т лимфоцитов человека,Возрастэмбрионов,нед Содержание клеток сдиффузным хроматиномв ядре,1,37 (0-4) и 12 97,2 2,8 7,5"8(97-974) (2,6-3) п=12 п=.15 3 опда 1 е а 1. Наличие Т-антигена иа поверхности лимфоцитов определяют с помощью цитотоксического теста, который ставят по Ковцго е 1 Воуье. Для проведения реакции используют сыворотку против Т-лимфоцитов человека.Обнаружено, что лимфоидные клетки тимуса эмбрионов человека 7,5- 8 нед развития практически не имеют рецепторов к эритроцитам барана, число розеткообраэующих клеток не превышает 4 и в среднем составляет 1,37. Антисыворотка не оказывает на эти лимфоциты цитотоксического действия во всех разведениях (см.таблицу). При исследовании под световым и электронным микроскопом лимфоци-15 тов тимуса эмбрионов человека 7,5- 8 нед развития обнаружено, что 97-97,4 клеток характеризуются наличием только диффузного хроматина или зухроматина в ядрах и отсутст О вием участков гетерохроматина. Клетки имеют неправильной Формы или округлые ядра с одним, двумя или тремя ядрышками, Электронноплотная цито- плазма этих клеток содержит небольшое число митохондрий и много свободных рибосом и полисом. Некоторые клетки имеют цитоплазматическйе отростки.Лимфоидные клетки тимуса эмбрионов человека 11-12 нед развития характеризуются появлением на поверхности рецепторов к эритроцитам барана и Т-антигена. 79 клеток Формируют розетки с эритроцитами барана и 60 клеток лизируются сывороткой против Т-лимфоцитов человека в разведении 1:10 (см.таблицу). При исследовании под световым и электронным микроскопом выявлено, что 91-95 лимфоцитов тимуса эмбрионов человека 11-12 нед развития содержит глыбки компактного 40 хроматина или гетерохроматина в ядрах, которые видны вблизи ядерной мембраны или свободно располагаются в нуклеоплазме. В некоторых клетках гетерохроматин в виде узкой полосы располагается у ядерной мембраны. Ядрышки уменьшаются в размерах, отростки исчезают, уменьшается количеетво свободных рибосом и полисом. Число лимфоидных клеток в тимусе эмбрионов человека 11-12 нед развития, имеющих рецепторы к эритроцитам барана и Т-антиген на поверхности и участки гетерохроматина в ядрах, достоверно увеличено по сравнению с числом таких клеток в тимусе эмбрионов человека 7,5-8 нед развития(Р с 0,01) .У плодов 17-24 нед развития 98,5 лимфоцитов тимуса содержат компактный хроматин в ядрах, который занимает большую часть ядра и образует в них сложный причудливый рисунок. Узкий ободок электронно плотной цито- плазмы этих клеток содержит небольшое число митохондрий и полисом.78 лимфоцитов тимуса имеют рецепторы к эритроцитам барана и 71,5 клеток лизируются антисывороткой в разведейии 1:10 (см.таблицу). Число клеток, имеющих поверхностные рецепторы к эритроцитам барана и компактный хроматин в ядрах, в тимусе плодов человека 17-24 нед развития достоверно увеличено по сравнению с их числом в тимусе эмбрионов человека 7,5-8 нед развития (Р 0,001) и достоверно не отличается от их числа в тимусе эмбрионов человека 11- 12 нед развития (Р 0,05),.Процентное содержание лимфоцитов в тимусе эмбрионов человека разных сроков развития, характеризующихся наличием диффузного или компактного хроматина в ядрах и антигенов дифференцировки - Т-антигена и рецепторов к зритроцитам барана.Использование предлагаемоного способа позволяет определить стволовые лимфоидные клетки СЛК точно, а не предположительно, в отличие от известного способа. Это открывает возможность более детальной характеристики популяции лимфоидных клеток при заболеваниях крови, в том числе и злокачественных, что важно при выборе метода лечения и оценки его результатов. Определение с помощью предлагаемого способа истинного числа СЛК в клеточных суспензиях обеспечит более правильный подбор донорской ткани для лечения. иммунодефицитных.состояний разной этиологии,(71-82)п=21 п=14 Формула изобретения Составитель С.МалютинаРедактор Г.Девятко Тхеред М. Кузьма Корректор Е.Папп Заказ 6271 36 Тираж 1019 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва Ж, Раушская наб., д.454 Филиал ППП"Патент", г.ужгород,ул.Проектная,Способ определения стволовых лимфоидных клеток на гистологическом препарате путем фиксации в глютаровом альдегиде и четырехокиси осмия, заключения в смолы и электронно-микроскопического анализа, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, ставят реакции на Т-антиген и ядерный хроматин в лимфоцитах и при наличии в ядре клеток только диффузного хроматинаопределяют принадлежность клеток кстволовым лимфоидным. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.Кавецкий Р.Е.,Бутенко З.А.,Зак К.П. и Клочко Э.В. О возможности распознавания гемопоэтическиххстволовых клеток методом электронноймикроскопии, ДАН СССР, 1974, т.217,25 р 1, с.207-209.