Способ выделения ацетоина

(и) 777059 Союз Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 07,11.80 3) УДК 663,11по делам изобретении открытии 72) Авторы изобретения И. Б. Романова, Т. М, Филиппова, Т. Б, Казанская и Ю. Г, Анюхина Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР(54) СПОС етоина из сстракцию последую ГосУдаРственный комитет (23) Пр ор Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу выделения ацетоина из культуральной жидкости микроорганизмов - продуцентов.Ацетоин - СН,СОСНОНСН, (3-окси- 5 бутанон, ацетилметилкарбинол) наряду с продуктом его окисления диацетилом является важным ароматическим фактором ряда пищевых продуктов, влияющим на их качество. Он встречается в хлебе, масле, 10 молоке, сырах, пиве, кофе, какао, меде, специях и т. д.Ацетоин и диацетил вносят в маргарин и другие отвержденные растительные масла для придания им запаха сливочного масла. 1,;Ацетоин также используется в пищевой и витаминной промышленности в качестве антиоксиданта - вещества, предохраняющего масла, жиры и растворимые витаминные препараты от окисления, 20Ацетоин образуется в культуральной жидкости некоторых микроорганизмов 11, 21. Однако в культуральной жидкости ацетоин обнаруживали аналитически и из среды не выделяли. 25Получают ацетоин обычно путем химического синтеза.Известен способ выделения ацраствора, предусматривающий эорганическим растворителем с щпм упарпванпем 3). При этом ацетоин выделяют из химической реакционной смеси. Все операции проводят в токе азота, что усложняет аппаратурное оформление процесса и увеличивает потери ацетоина, обладающего высокой летучестью, за счет уноса газом. Полученный продукт представляет собой ацетоин, который быстро окисляется воздухом и не подлежит длительному хранению.Целью изобретения является увеличение срока хранения конечного продукта и упрощение процесса.Указанная цель достигается тем, что в качестве исходного раствора используют культуральную жидкость микроорганизмов - продуцентов, при этом перед экстракцией культуральпую жидкость обрабатывают серной кислотой для удаления примесей, а после упаривания продукт кристаллизуют в присутствии гранулированного цинка, В качестве продуцентов ацетоина используют бактерии АегоЬас 1 ег (ЕпсегоЬассег) с 1 оасае ИНМИ-ЗО, или Ег ьчп 1 а сого 1 о ога ВКМ В, или АегоЬас 1 ег (ЕпсегоЬассег) аегодепез ВКМ В, выращенные на углеводных средах.Способ осуществляют следующим образом.Бактерии указанных видов культивируют на минеральной питательной среде с глюкозой или мелассой в качестве источники углерода. При этом в культуральной жидко. сти накапливается 17 - 19 г/л внеклеточного ацетоина. Культуральную жидкость, освобожденную от клеток, обрабатывают концентрированной серной кислотой, При этом осаждаются побочные продукты, препятствующие выделению ацетоина.Необходимо использовать именно серную кислоту, так как только ею переводятся в осадок основные мешающие примеси, другими кислотами примеси не есаждаются. Осадок отделяют и ацетоин экстрагируют эфиром.Кислый экстракт сушат прокаленным поташом, Поташ, имея щелочную реакцию, одновременно осушает и подщелачивает экстракт. Подщелачивание экстракта необходимо, потому что щелочная среда предотвращает окисление ацетоина в диацетил при дальнейшем нагревании.Упаривание эфира проводят при атмосферном давлении и температуре бани не выше 45 - 50 С, Эфир удаляют полностью.Остаток после упаривания экстракта еще содержит примеси, избавиться от которых с помощью разгонки невозможно из-за летучести ацетоина. С целью выделения ацетоина из остатка используют его свойство образовывать кристаллический димер, который получают в присутствии гранулированного цинка.Идентификацию полученного ацетоина проводят методами газожидкостной хроматографии, ИК-, ЯМР-спектроскопии, определением точки плавления и элементного состава.П р и м е р 1. Штамм АегоЬас 1 ег (Еп 1 егоЬас 1 ег) с 1 оасае ИНМИвыращивают в пробирках на мясо-пептонном агаре (МПА) при 26 С. Через 48 ч роста культуру с МПА пересевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл питательной среды. Пересев проводят 1 мл суспензии бактерий, полученной смывом 48-ч культуры с МПА стерильной водопроводной водой из расчета 1 пробирка на 16 колб, содержащих по 50 мл среды.Состав жидкой питательной среды, вес. %:Глюкоза 10,0 ХН 4 С 1 0,6 КН 2 Р 04 0,1 Мазо, 0,03 СаСОз 3,4 Дистиллированнаявода ОстальноерН среды до и после стерилизации 6,9. Стерилизацию солевой среды без глюкозы и СаСО, проводят в автоклаве при 116 С (3/4 атм). Глюкозу в виде 50%-ного раствора в дистиллированной воде стерилизуют в автоклаве при 110 С (1/2 атм), СаСО, расфасованный по 1,7 г в сухих пробирках, стерилизуют сухим жаром при 170 С. Раствор мелассы и СаСО, вносят в колбы с ос 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 новной солевой средой перед засевом ее бактериями.Ферментацию проводят при непрерывном перемешивании на качалке, 220 об/мин, 26 С в течение 5 суток, после чего центрифугированием биомассу отделяют от жидкой среды.200 мл культуральной жидкости с содержанием ацетоина 17 г/л обрабатывают 5 мл концентрированной серной кислоты и помещают в холодильник для формирования осадка. Образовавшийся аморфный осадок отфильтровывают на стеклянном фильтре4 и промывают эфиром. Фильтрат вместе с промывным эфиром переносят в делительную воронку и энергично встряхивают в течение 5 мин.Экстракцию производят многократно диэтиловым эфиром. Образующуюся эмульсию разрушают фильтрованием через стеклянный фильтр4. Объединенный эфирный экстракт нейтрализуют и сушат прокаленным поташом. Поташ отфильтровывают и промывают на фильтре абсолютным эфиром. Фильтрат и промывной эфир объединяют, упаривают при 50 С до прекращения выделения паров эфира. В остаток вносят 3 гранулы цинка, Смесь помещают в морозильную камеру холодильника на сутки, Образовавшиеся бесцветные кристаллы димера ацетоина отжимают на фильтре, перекристаллизовывают из ацетона и сушат в вакуумном эксикаторе над Р.О и парафином. В ы ход ацетои на 1,88 г (55,3% ) .П р и м е р 2, Штамм ЕгМп 1 сого 1 осога ВКМ Ввыращивают в пробирках на картофельном агаре при 26 С. Через 48 ч роста культуру с картофельного агара пересевают в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл питательной среды с мелассой в качестве источника углерода,Состав жидкой питательной среды вес. %:Меласса 20,0КН 4 С 1 0,5КН,Р 04 0,1Мдзо, 0,03СаСО, 3,4Дистиллированная вода ОстальноеПересев проводят 1 мл суспензии бактерий, полученной смывом 48-ч культуры с картофельного агара, стерильной водопроводной водой из расчета 1 пробирка на 10 колб, содержащих 50 мл среды, Далее аналогично описанному в примере 1 получают культуральную жидкость с содержанием ацетоина 13 г/л 200 мл. Культуральную жидкость обрабатывают аналогично описанному в примере 1. Выход ацетоина 1,38 г (53,1% ) .П р и м е р 3. Ферментацию штамма АегоЬас 1 ег (Еп 1 егоЬасег) аегодепез ВКМ-Впроводят аналогично описанному в примере 1, а экстракцию культуральной жидкости с содержанием ацетоина 18,5 г/л проводят непрерывно. Остаток пос777059 Составитель Т. Мелентьева Корректор В. Борисова Редактор П. Горькова Техред И, Пенчко Заказ 2543/10 Изд. Мв 598 Тираж 522 Подписное НПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж.35, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр, Сапунова, 2 ле упаривания с внесенным й него цИнком перемешивают магнитной мешалкой при охлаждении (баня с ацетоном и сухим льдом) в течение 2 ч, Затем смесь помещают в холодильник, Выход ацетоина 1,68 г (45,3%).Описанный способ позволяет осуществить выделение ацетоина из культуральной жидкости, полученной ферментацией микроор. ганизмов - продуцентов ацетоина. Препарат, полученный микробиологическим синтезом, выделяют химически чистым, в виде кристаллического димера. Он более устойчив к хранению, чем жидкая форма ацетоина и может быть использован в пищевой и витаминной промышленности. Возможность проведения всех операций выделения без тока азота упрощает и удешевляет процесс, одновременно исключая потери ацетоина за счет уноса.Формула изобретения1. Способ выделения ацетоина из раствора, предусматривающий экстракцию его органическим растворителем с последующим упариванием, отл и ч а ю щи й с я тем, что, с целью увеличения срока хранения конечного продукта и упрощения процесса, в качестве исходного раствора используют культуральную жидкость микроорганизмовпродуцентов, при этом перед экстракциейкультуральную жидкость обрабатываютсерной кислотой для удаления примесей, апосле упаривания продукт кристаллизуют в5 присутствии гранулированного цинка.2. Способ по п. 1, отличающийсятем, что в качестве продуцента используютбактерии.АегоЬас 1 ег (Еп 1 егоЬас 1 ег) с 1 оасае10 ИНМИ-ЗО.3, Способ по п, 1, отличающийсятем, что в качестве продуцента используютбактерии Егюп 1 а сого 1 очога ВКМ В,4. Способ по п. 1, отличающийся15 тем, что в качестве продуцента используютбактерии АегоЬас 1 ег (Еп 1 егоЬас 1 ег) аегоепез ВКМ В.5. Способ по пп. 1, 2, 3, 4, отл и ч а ющий ся тем, что микроорганизмы - проду 20 центы выращивают на углеводных средах,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1.,Патент Японии Мо 48-14952, кл,36/2/Р 23, опублик. 1973.2. Авторское свидетельство СССРМэ 200414, кл. А 23 С 15/02, 1967.3, Меррей А Уильямс Д, Л. Синтезы органических соединений с изотопами углерода, ч. 2, М., ИЛ., 1962, с. 47.