Способ культивирования вирусов

ОпиСАН Союз Советских Социалистических Республик(22) ЗаЯвлено 19,02. 79 (21) 2727583/28-13с присоединением заявки Мо(51)М, Кл,з С 12 М 7/00//С 12 М 7/00С 12 й 1/91 Государственный комитет СССР ао делам изобретений и открытий(72) Авторы изобретения Л.Л.Миронова, В.П.Грачев, Н.В.Кузнецова и В.Д.Попова Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР(54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ Изобретение относится к вирусоло гии.Известен способ культивирования вирусов Путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьяны Г 13Недостатком известного спосбба является отсутсвие стандартных свойств отдельных клеток, поддержива О емых в разных лабораториях мира, а также контаминация посторонними агентами. Кроме того, в нем используется дифицитная эмбриональная сыворотка.Цель изобретения - упростить способ..Эта цель достигается тем, что вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647. 20 Полученная линия клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 имеет следующие морфологические и биологические свойства.Культура представлена округлыми эпителиоподобными клетками, цитоплазма не вакуолизирована, ядро срдержит мелкозернистыйгетерохроматии и 1- 2 ядрышка. Клетки линии 4647 образуют монослой на вторые сутки после субкультивирования, причем монослой удаетсяполучать даже при внесений в 1,5-литровую матрасную колбу 4 10 о клеток,Время удвоения популяции составляет24 ч. Коэффициент развивки достигает величин 1:2, 1:3, для пассирования клеток используют смесь основнойсреды Игла с 0,5-ным гидролизатомлактальбумина и 5-10 сывороткикрупного рогатого скота. Клетки линии 4647 сохраняются в жидком азотеболее двух лет без снижения пролиферативной активности, способны длительное время оставаться на стеклебез субкультивирования и смены среды, а также выдерживать в течение21 дня агаровое покрытие с аминопептидом и бикарбонатом натрия.Клетки линии 4647 чувствительнык различным вирусам: вакцинному штамму вируса чумы плотоядных, вакциннымштаммам вируса полиомиелита, пенящимвирусам, а также к цитомегаловирусуобезьян.П р и м е р 1. Способ культивирования вируса чумы плотоядных ",В 1,5-литровую матрасную колбу сперевиваемыми клетками почек взрослой.пассажа вводят 0,25-ный раствортрипсина, подогретый до 37 оС. Через30 с трипсин удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при 37 оСна 3 мин. Затем оставшиеся клеткиресуспендируют в среде роста - смесь0,5-ного гидролизата лактальбумина,на растворе Хенкса со средой Игла вравных количествах и 10 сывороткикрупного рогатого скота.Взвесь разливают на две матрасные колбы. Этикультуры на уровне 48 пассажа инку-.бируют при 37 оС в течение 2 сутокдо момента формирования сплошногослоя.При заражении вирусом среду сливают из культуральных сосудов, клеткиоднократно промывают раствором Эрлаи в каждую матрасную колбу вводятпо 10 мл жидкости, содержащей 3,39БОЕ/мл вируса. Для адсорбции вирусакультуры выдерживают при 34 оС в течении 1 ч при постоянном покачивании, после чего добавляют поддерживающую среду - смесь 0,5-ного гидролиэата локтальбутина на раствореЭрла со средой Игла в равных количествах и 5 аминопептида. Инфицированные культуры инкубируют при 34 оС.На пятые сутки поддерживающую средуудаляют и в сосуды наливают новыепорции среды того же состава. Сборвируса проводят на 8 день после заражения и определяют его титр пометоду образования бляшек. Титр равен 5,3 19 БОЕ/мл,При культивировании вируса в,первичной культуре клеток почек обезьянтитр вируса достигает 4,0 1 у БОЕ/мл. П р и м е р 2. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм. Сэбина" 1 типа.Клетки перевиваемой линии 4647 получают и готовят к заражению по описанному в примере 1 способу.При заражении вирусом полиомиелита, штамм"Сэбина" 1 типа, среду иэ культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вирусодержащую жидкость иэ расчета 3 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0,5-ного гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса со средой Игла в равных количествах.Инфицированные культуры инкубируют при 34 сС, Сбор вируса производят на четвертый день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек. Титр составляет 7,5 1 д БОЕ/мл.При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян получаются аналогичные результаты.П р и м е р 3, Способ культивирования пенящего вируса обезьян. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 б 5 Клетки линии 4647 на уровне 45 пассажа определяют от стекла по методу, описанному в примере 1, и эксплантируют в литровую роллерную бутыль в количестве 60 х 10 ь клеток. Культуру инкубируют при 37 ОС во вращающемся состоянии со скоростью 18 об/ч в течение 24 ч до момента формирования монослоя, При заражении вирусом: среду иэ культуральных сосудов сливают, клетки промывают физиологическим раствором и вводят вирус из расчета 10 ТЦД /мл в объеме 30 мл поддерЬживающей среды. Вращательным движением вируссодержащую жидкость равномерно распределяют по монослою.Адсорбцию вируса проводят при 3 оС в течение 1 ч при постоянном вращении Затем вирусодержащую жидкость удаляют, а в сосуд вводят 00 мл поддерживающей среды с 1 сыворотки телят. Культуральные сосуды помещают в барабан и вращают с той же скоростью при 3 оС в течение 4 дней. После этого проводят сбор вируса с последующим титрованием по развитию цитопатического эффекта. Титр вируса составляет 10ТЦП /мл.Параллельно этйм вирусам.заражают культуру клеток почек обезьян в матрасной колбе, находящейся в стационарном положении. В ней вирус размножается до титра 10ТЦД /мл,БОДля получения антигена к пенящему вирусу клеточный пласт снимают замораживанием в смеси спирта с сухим:льдом. Разрушенные клетки осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость используют в качестве антигена и сохраняют при температуре -10 ОС. "Нормальный" антиген из незараженных клеток 4647 получают в аналогичных условиях.Перед использованием в РСК анти- гены предварительно проверяют на антикомплементарную специфичность.и ан" тигенную активность.Предлагаемый способ позволяет рас" ширить виды клеточных субстратов, используемых для культивирования вирусов. Применение перевиваемой линии клеток почек взрослой зеленой мартышки 4647 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов в связи с тем, что может заменить дорогостоящие первичные клетки почек обезьян. Кроме того клетки линии 4647 обладают стандартными биологическими и морфологическими свойствами, не содержат мико- плазм, имеют высокую пролиферативную активность, легко культивируются на отечественных средах и сыворотках, не теряют своих свойств при хранении в жидком азоте и имеются в запасе.Использование для культивирования вирусов клеток линии .4647 расширит770195 формула изобретения Составитель С.йаяетииа Редактор М.Кузнецова Техред С. Мигунова Корректор В,БутягаЗаказ 5757/38 Тираж 528 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035,Москва,Ж,Раушская наб.,д. 4/5филиал ППП "Патентф, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 возможности успешной диагностикивирусных инфекций, позволит получатьв значительных количествах антигеныпенящего вируса и цитомегаловирусаобезьян, приготавливать вакцины дляветеринарной практики. Способ культивирования вирусов путем размножения на линии перевиваемых клеток почки обезьян, о т л и -ч а ю щ и й с я тем, что с цельюупрощения способа, вирусы размножают на линии перевиваемых клеток почки взрослой зеленой мартышки 4647.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Норра Н.Е.ас.а 1, 81 о 1 од 1 са 1сИагасйег 1 ьс 1 св оГ а аег 1 а 111 сц 1- йчайеЬ М 1 Ьпеу се 1 з ЬегчеЬ Ггоа йЬеаг 1 сап дгееп еопМеу, Сегсор 1 йЬесцваесЬ 1 оря. РеЬ 1 гай 1 оп РгосееЬ 1 пдь,1962, 21,454.