Способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях

Союз СоввтсинкСоцнапнстнчесинкРеспублик ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(51)М. Кл. С 01 И 33/Й 8 ГоеударетвекыВ кемнтет ссер во делен. изебретекик и открытк 11(72) Авторы изобретения ститут эволюционной физиологии и бион им. И.М. СеченоваЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ растя илира йода. Изобретение относится к биохимии и касается определения актив,ности ферментов.Известен способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях путем измерения скорости изменения потенциала окислительновосстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологически жидкость с добавлением субстрата 1 11,Однако известный способ обладает недостаточно высокой чувствительностью (0,5-0,005 е/мл).Цель изобретения - увеличение чувствительности способа.Указанная цель достигается тем, что способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях осуществляют путем измерения скорости изменения потенциала окислительно-восстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстрата, электрод предварительно уравновешивают в 10 -10-1 воре ферротферрицианида ка в 10 -1 О М водного раст На фиг,1 приведены кривые зависимости потенциала от времени гидролиза ацетилтиохолин бромида при различных активностях холинэстеразы сыворотки крови лошади (электрод ЭОпредварительно уравновешен в О, 1 М раствора ферро-феррицианида калия; активность фермейта на кривых 1-6 соответственно равна 10;10,1; 0,01; 0,001 и 0,00012 е/мл, на кривой 7 представлен спонтанный гидролиз); на фиг, 2 - кривые зависимости потенциала от времени гидролиза ацетилтиохолин бромида при различных активностях холинэстеразы сыворотки крови лошади (электрод ЭОгредварительно уравновешен в 5 .10 М растворе 1, активность фермента на кривых 1-6 соответственно равна 10; 1; 0,1; 0,01; 0,00193438 3и 0,0001 е/мл, на кривой 7 представлен спонтанный гидролиз),П р и м е р 1. В термостатируемуюкювету объемом 2 мл наливают 1,0 млраствора Фермента бутирилхолинэстера.зы сыворотки крови лошади на 0,1 Мфосфатном буФере рН 7,4 - 8,0 с активностью от 20 до 210 4 е/млЭлектрод ЭОпредварительно уравновешивают в 0,1 И растворе ферро-ферри- Оцианидов, затем промывают 3-4 разаводой и помещают в исследуемую реак 1,ционную смесь. Электродом сравненияслужит хлорсеребряньй электрод внасыщенном растворе хлористого калия %(ЭВЛМ), Электроды подключают крН-етру рНили рН. Потейциал системы всегда составляет236 мВ. Затем добавляют 1 мл 2. 10 Мацетилтиахолин бромида и измеряютскорость падения потенциала в диапазоне 200-100 мВ (фиг.1). После окон.чания измерений электрод промываютнесколько раз водой, помещают нанесколько минут в раствор Ферри"Ферроцианидов, после чего он сноваготов к работе.П р и м е р 2. В термостатированную кювету объемом 2 мл наливают1,0 мл раствора фермента бутирил- зхолинэстераэы сыворотки крови лошадина 0,1 И Фосфатном буфере рН 7,48,0 с активностью от 20 до 2 10 е/мли 0,01 мл свежеприготовленного.вод"ного раствора 1 (5 10 М) В растворззпомещают индикаторный электрод ЭО"1и хлорсеребряный электрод сравнения.формула изобретения Способ определения активностихолинэстеразы в биологических жид"костях путем измерения скорости изменения потенциала окислительно.восстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологическуюжидкость с добавлением субстрата,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что,с целью увеличения чувствительностиспособа, электрод предварительноуравновешивают в 10- 10 " И растворе ферро-Феррицианида калия или в10 -. 10 И водного раствора йода,Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Кгавег 0.М., Саппоп Р.1,. апйСц 1 Ьац 1 С 6,6; Е 1 есСгосЬец,са 1ЙеСеппхпаСиа оЕ сЬо 1 хпгяСегаяеапд ОйосЬо 1 хпе езСегя. "Апа 1 уСса 1сЬепзСгу", 19 б 2, 34, У 7, р, 8428 И. 0 4Устанавливают потенциал 412 мВ, Затем в реакционную смесь вносят 1 мл 2 10 М ацетилтиохолинбромида и измеряют скорость падения потенциала от 400 до 300 мВ (фиг.2). После опыта электрод промывают также, как указано в примере 1.Предлагаемый способ позволяет увеличить чувствительность до 1,210 4 е/мл и диапазон измерения активности холинэстеразы (1.0 10 4 е/мл).