Способ определения активности изоферментных фракций адеаминникотинамиддинуклеотидфосфатзависимой изоцитратдегидрогенозы

(23) ПриоритетОпубликовано 15,06,80. Бюллетень22 по делам изобретений и открытий,(53) УДК 616-074( 088.8) Дата опубликования опнсанйя 18 06 80 И, Я, Конь и Л. И. Ширина(72) Авторыизобретенияс Центральный ордена Ленина институт усовершенствованияврачей(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ИЗОФЕРМЕНТНЫХ ФРАКЦИЙ АДЕНИННИКОТИНАМИДДИНУКЛЕОТИДФОСФАТЗАВИСИЯ ОЙ ИЗОЦИТРАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 1. -Изобретение относится к областимедицинской биохимии, а именно определению активности ферментов,. Известен способ определения активности изоферментных фракций аденинникотинамиддинуклеотидфосфат-зависимой изо 5цитратдегидрогеназы (А НАДФ-ИДГ) путемалектрофоретического разделения исследу-,емого материала в полиакриламидном геле с последУющей инкубацией геля и растЧОворе, содержащем феназинметасульфати тетразолий, и определением отдельныхизоферментных фракций по оптическойплотности окрашенных зон геля 11,Однако, атот способ. является недостаточно чувствительным и не позволяетс достаточной степенью достоверности. судить об активности минорных изоферментных фракций (1, 3, 4 и 5-й) и ихизменениях при различных воздействиях,. а также требует длительной инкубации,необходимой для появления окрашивания,Целью изобретения является повышениеточности и ускорение способа. 2Это достигается тем, что в инкубационную среду дополнительно вносят раствор ретинола или ретинил-ацетата в концентрации 2-3 мг/мл,Предлагаемый способ осуществляютследующим образом.С помощью зонального алектрофорезав полиакриламидном геле в стандартномаппарате для электрофореза осуществляют разделение изоферментов АНАДФ ИДГ,Исследуемый материал (вместе с Сефадексом 6 -25) вносят с помощью пипетки в трубки, содержащие ступенчатыйградиент геля (10% 7 5%ф 3 5%) врасчете на акриламид. В качестве концентрирующего слоя используют суспензию Софадекса - 200, Исследуемый материал вносят в трубку из расчета2-3 мг белка на трубку. Электроднымбуфером служит раствор трис-НС 1 буфера (рН 8,3; 0,5 М). Длительность электрофореза.составляет около 4 ч при силетока 2 мА на трубку. Об окончании электрофореза судят по продвижению индика0,085 0,660 0,041 О 3 3,2 4,8 0 0,03 0,04 0,2 мула ения ламидном геле с послеей геля в растворе, сонметасульфат и тетразоием отдельных изоферменоптической плотности окля, отличаючто с целью повышения о риала в полиакри дующей инкубаци держащем фенази лий, и определен тных фракций по рашенных зон ге щийся тем,Способ определментных фракций алеотидфосфат.зависгеназы ( НАДФ-ИД" "тического -разделен ения активности изофер- денинникотинамиддинукимой иэоцитратдегидро . Г) путем электрофореия исследуемого фмате-,3 7402 Э 4 фторой краски-бромфенолового синего, Предлагаемый способ значительно по. Для очистки геля проводят предваритель вышает активность всех изоферментныхный електрофореэ в режиме, соответствуфракций НАДФ-ИДГ. При этом наиболееющем режиму основного електрофореза. эначитольно возрастает активность 1-йПосле окончания електрофореза гели из (в среднем в 1 7 раэ) и 5 й фракции .влекают иэ трубок,и помещают в пробир- (в среднем в 5 раэ). Активность осталь., - ки, заполненные инкубационной средой ных фракций (2,3,4-й) повышается вдля выявления активности НАДФ-ИДГ, 3-5 раз. При этом внесение в среду вивключающей 0,05 М глицил-глйциновый тамина А позволяет в ряде случаев выябуфер рН 8,6 НАДФ,7 мМ, МрО 5 мМ 10 вить активность так называемых минор, ЙаСИ -2 мМ, МИРЛО - 15 мМ, тринатрие- ных (1, 3, 4 и 5-й) фракций, не выяввую соль иэолимонйой кислоты -:ляющуюся (или выраженную в чрезвычайl0,015 мМ, нитросиний тетразолий -но малой степени) при использовании0,36 мМ, раствор ретинола или ретинил-известного способа,ацетата в концентрации 2-3 мг/мл, Пробирки помещают в термостат и инкуби-При внесении в инкубациойную средуоруют в течение 10 мин при 37 С, Затемвитамина А развитие интенсивности ок, в каждую пробирку вносят феназинмета-. раски происходит уже на 10 - 20-й мисульфат в концейтрации 0,06 мМ и инку- нутах инкубации, тогда как при испопьзобируют пробы в течение 5-20 мин при 2 О ванин существующего метода для разви. :той же температуре. Интенсивность окра- . тия выраженной окраски требуется нешивания в зонах локализации изофермент-.менее 30-40, а в ряде случаев и 60 мин,ных фракций регистрируют с помощью ден-ситометра. Активность изоферментных .фракций НАДФ-ИДГ вы ажат в словны 25 Средние результаты исследований поединицах оптической плотности (пропо . "сопоставлению определения активностициональной площади окрашеннйх зон) в . изоферментных фракций НАДФ независимойпересчете на 1 мг белка в исСледуемом изоцитратдегидрогеназы с помощью изобразце за 1 мин времени инкубации .вестного и. предлагаемого способов приве при 37 С,30 пены в таблице.б Источники информации,принятые во вниманиепри экспертизе 1, Вестнйк АМН СССР, Ж 11 с.51,1971,.5 740234 точности и ускорения способа в инкубационную среду дополнительно вносят раствор ретинола или ретиннп-ацетата в конечной концентрации 2-3 мг/мл.Составитель С. МалютинаРедактор Н; Потапова Техред Н, Бабурка КорректорС. ЩомакЗаказ 3072/4 Тираж 673 ПодписноеЦНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская набд. 4/5филиал ППП."Патентф г, Ужгород ул. Проектная, 4