Способ определения активности биопрепаратов

О П И С Л"-Н И Е ИЗОБРЕТЕНИЯ ои 675649 Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 020276 (21) 2318963/28-13 (51) М. КЛ.2 с присоединением заявки М А 61 К 31/00 а 01 И 33/16 Государственный комитет СССР но делам изобретений и открытий(088. 8) Опубликовано 280280 Бюллетень Й 9 8 Дата опубликования описания 280280(72) Авторы изобретения Б.С. Касавина и Т.В. Ухина Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИБИОПРЕПАРАТОВ Изобретение относится к областимедицинской биохимии и предназначено для исследования действия биологически активных веществ на мембраны лизосом тканей.Известен способ определения активности биопрепаратов при действии на лиэосомальную мембрану путемиспытания их юч 1 чо и 1 т 1 ч 1 О О (1)Однако известный способ не обеспечивает высокой точности;Целью изобретения является повышение точности способа.Эта цвль достигается тем, чтоиспытуемый препарат вводят с де- . 15эоксикортикостероном, определяют активность лиэосомальных ферментовразличных тканей и по изменениюуровней этих ферментов определяютактивность биопрепаратов; дезоксикор тикостерон берут в концентрации5-15 мг/кг.Способ определения активностибиопрепаратов осуществляют следующим образом. 25Проводят исследование действиясемнкарбозида и мезатона на склеру,роговицу и цилиарное тело,В опытах ю чиччо испытуемый препарат вводят кроликам внутрнбрюшин но в дозе 15 мг/кг веса. Через 1 час после введения препарата кролика забивают, выделяют склеру, роговицу, цилиарное тело и тщательно их очищают от подлежащих тканей. Измельченные ножницами ткани гомьгениэируют в сахароэной среде (0,25 М сахароза, приготовленная на трисНС 1 буфере, рН 7,4, с добавлением Ь,001 М ЭДТА). Гомогенизацию проводят в гомогенизаторе типа Поттера с тофлоновым пестиком при помощи микроиэйельчителя тканей РТ(склев ру гомогенизируют 6 мин, роговицу 15 мин, цилиарное тело 1 мин),В опытах 1 н ч 1 Фго выделенные ткани помещают на 1 ч в термостат (при 37 С) в сахарозной среде с добавлением испытуемого препарата в дозе 1 мг/мл.Для получения субклеточных фракций гомогенаты центрифугируют при 900 ф в течение 20 мин в центрифуге К. Полученный недостаток центрифугируют при 6000( в течение 30 мин. Осадок (фракция метохондрий) промывают и центрифугируют при 6000в течение 10 мин. Осадок регомогенизируют в сахарозной среде (первоначальном объеме). Объеди,2+0,0 6,9+1 2,80+ 0,1+1 нид Гнал юкоэидаза общаясвободная-Гиалуронидаза 3ненные недостаточные фракции центрифугйруют в течение 1 ч при 105000 в центрифуге АС. Супернатаит осторожно отбирают пастеровской пипеткой(фракция цитозоля) . Все описанные операции проводят на холоду (не выше 4 дС) . 5 В гомогенатах и субклеточных фракциях определяют свободную и об" щуюактивности гликозидаэ. Общую активность ферментов исследуют после полного разрушения субклеточных структур путем добавления в инкубационную среду доторгента-тритон-х. Принцип метода определения активности лиэосомальных гликоэидаз основан на спектрофотометрическом исследова" нии количества образовавшегося продукта ферментативной реакции. Активность -галактозидаэы и р-глюкозидазы определяют по методу ю ч(чо и ю чего В качестве субстрата для определения-галактозидазы используют р-нитрофенил- -Д-галактопиранозид, а для Р-глюкозидазы - ( -нитрофенил-Д-глюкопиранозид. Активность гиалуренидаэы дпределяют по методу 2(экие . В качестве субстрата используют калиевую соль гиалуреновой кислоты, Активность ферментов выражают в микромблях расщепленного субстрата за 1 мин на 1 г белка. Количество белка определяют по методу 1,оаг. В таблице приведены результаты определения активности гликоэидаэ в гомогенатах и субклеточных фракциях в норме и при воздействии на ткани глаза семикаобоэипом..Редактор Н; Белявская Техред Э,Чужик Корректор М, лароши Заказ 10010/9 Тираж 673 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/54Филиал ПЙП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,Для оценки результатов исследования, например в цилиарном теле,подсчитывают процент отношениясвободной активности-глюкозидаэы к общей в митохондриальной фракции, содержащей большую часть лиэосом (по данным проведенной намиэлектронной микроскопии для.контроля эа чистотой фракции); такжеподсчитывают процент активностифермента в цитазоле от активностив гомогенате. В норме отношение свободной активности к общей составило 40,6, а после. действия семикарбозида - 66,7; процент выхода фермента в цитозель составлял в норме6,7, а после действия препаратаувеличился до 9 (статистическидостоверно) .Следовательно, семикарбозид вызывает увеличение процента свободной активности от общей мембраносвяэанной -глюкозиданы в митохондриальной фракции и повышение выхода лизосомальных ферментов в цитозоль.Эти данные свидетельствуют о.том, что семикарбозид уменьшаетпрочность связи 5-глюкозидаэы смембраной, т. е. лабилйзирует мембраны лизосом цилиарного тела, Лабилизация лизосомальных мембран способствует выходу ферментов иэ лизосоми увеличению фермент-субстратноговзаимодействия, что может привести к усилению распада мукополисахаридов ткани,Однозначность результатов опытов с семикарбозидом ю ч 1 чО и 1 и чего свидетельствует о том, что этот препарат действует непосредственно на мембраны лизосом, без промежуточ" ных звеньевПредлагаемый способ обеспечивает возможность получения сведений о механизме действия веществ на мембра-, ны лизосоМ, высокую точность определения, а также позволяет подбор оптимальной дозировки и обоснования применения того или иного препарата. 1Способ определения активности биопрепаратов при действии нализосомальную мембрану путем испытания их Ю чьчо и м чгО, о т -р л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности способа,испытуемый препарат вводят с дезоксикортикостероном, определяют активность лизосомальных ферментовразличных тканей и по изменениюуровней этих ферментов определяютактивность биопрепаратов.2 Способ по и. 1, о т л и,ч а ющ и й с я тем, что дезоксикортикостерон берут в концентрации 5 ф 15 мг/кг.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Вопросы медицинской химии.,т. хх 1 у вып. 3, с. 307, 1975