Способ получения глюкозоизомеразы

О П ИСАЙИ"Е ИЗОБРЕТЕНИЯ пщ 655327 Союз Советских Социалистических Республик(088.8) по делам изобретений и открытий(45) Дата опубликования описания 30,03.79(72) Авторы изобретения Иностранцы Кеннет К. Ши (КНР), Говард А. Ли(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ 1Изобретение относится к способам получения глюкозоизомеразы с использованием микроорганизмов вида Ас 11 пор 1 апез.Глюкозоизомераза служит для превращения глюкозы непосредственно во фруктозу., поэтому вопросы, связанные с получением этого фермента, имеют важное значение.Для повышения выхода глюкозоизомеразы при культивировании ее продуцентов в питательную среду добавляют ксилозу или ксилан.Однако ксилоза - дорогой компонент, а если добавлять ксилан, то для продуцирования глюкозоизомеразы необходимо использовать только такие микроорганизмы, которые являются одновременно и продуцентами фермента, вызывающего гидролиз ксилана.Известен способ получения глюкозоизомеразы путем культивирования микроорганизмов (культуры 51 гер 1 отпусез о 11 часепз) ее продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, без внесения при этом добавок в виде ксилозы или ксилана 111.Однако активность получаемого по этому способу фермента недостаточна. 2Целью изобретения является повышение активности фермента,С этой целью в качестве продуцента используют микроорганизмы вида Ас 11 пор 1 апез, причем целесообразно из этого вида использовать штаммы Ас 11 пор 1 апез тп 1 ззоцг 1 епз 1 з ХККЬ В, Ас 11 пор 1 апез рЫ 111 ррепз 1 з АТСС 12427, Ас 11 пор 1 апез агптеп 1 асцз АТСС 15676, Ас 11 пор 1 апез зр. АТСС 23342.В качестве источника азота используют или жидкость после замачивания кукурузы, или барду, или гидролизат казенка, или гидролизат соевых бобов, или гидролизат белка рыб, или их смесь.Предлагаемый способ заключается вследующем,Исходные культуры вида Ас 11 пор 1 апез культивируют в среде, содержащей источники углерода, азота (например, жидкость ,после замачивания кукурузы) и минеральные соли, при температуре 25 - 30 С, впри,сутствии воздуха в течение 1 - 2 суток. При этом среду с культурой размещают на вращающемся вибростоле.Выращенную культуру переносят в стерильную среду, находящуюся в ферменте65 ре, инкубируют, перемешивая, при темпе. ратуре от 16 до 40 С (предпочтительно при 25 - 30"С) и скорости протекания потока воздуха 1 объем в минуту в течение 1 всуток.Скорость подачи воздуха можно изменять от 0,3 до 1,5 объема в минуту. Для получения максимального выхода фермента величину рН фсрментационной среды поддерживают в интервале между 6,0 и 8,5 (предпочтительно между 6,4 и 7,5), Максимальная активность изомеразы в этих условиях достигается по прошествии 3 - 5 суток, После этого отделяют клетки микроорганизмов и используют их как источник фермента. Возможен и другой вариант, когда фермент экстрагируют из клеток,Уровень активности, приближающийся к 30 единицам на 1 мл оульона культуры, достигается по прошествии 3-х суток. единица активности определяется как то количество фермента, которое можетобразовать 1 мкмоль фруктозы из глюкозы за 1 мин при температуре 75"С в среде, характеризующеися 1,5 М по глюкозе, 0,03 М по фосфатному буферу с величинои рН 7,0, 0,003 М по сульфату магния и 0,0003 М по сульфату двухвалентного кобальта.Уровень активности изомеразы, достигаемыи при практическом осуществлении настоящего изооретения, меняется в зависимости от применяемого штамма и используемой для выращивания среды. Уровень активности, составляющий 50 единиц на 1 мл бульона культуры, имеет место при культивировании культуры Асйпор 1 апсэ гп 1 ззоцг 1 епз 1 з 1 ККЬ Ына среде, содержащей жидкость после вымачивания кукурузы.Хорошую активность получают и при культивировании Ас 11 пор 1 апез рЫ 111 ррепяэ А 1 СС 12427, Ас 11 пор 1 апез аппегпасцз Л 1 СС 15676 и Асйпор 1 апез зр, АТСС 23342,Исследование большого количества видов Асйпор 1 апез показало, что практически все виды этой культуры, их суокультуры, мутанты и разновидности способны продуцировать глюкозоизомеразу и поэтому могут быть пригодны для осуществле.ния описываемого способа.Такое положение объясняется следующим. Поскольку стенки клеток микроорганизмов вида Ас 11 пор 1 апез содержат ксилозу (преимущественно Д-ксилозу), организм должен быть способным синтезировать пептозу. Единственным метаболическим путем для синтеза Д-ксилозы является изомеризация Д-ксилозы изомеризирующим ферментом Д-ксилозоизомеразой, который также обладает способностью изомеризации глюкозы во фруктозу. Д-Ксилулоза может быть ооразована из Д-ксилулозо-фосфата при воздействии фосфатазы. Последнее соединение, т. е. Д-ксилулозо-фосфдт, явля 5 10 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 55 60 ется важным промежуточным соединением при образовании гексозо-монофосфато-пептозы.Ниже дана схема биосинтеза Д-ксилозы в Ас 11 пор 1 апеэ.Гексозо-монофосфатно-пептозный путь: 1 люкоза АТфД-ксилулозо-фосфат -- .; -- - Д-ксилулоза- - Д-ксилоза - - )- изомеризациястенки клеток.11 оскольку клеточные стенки Асыпор 1 апеь содержат Д-ксилозу, поэтому все они, как можно ожидать, содержат изомеризующии фермент.11 р имер, 11 о этому принципу получают фермент глюкозоизомеразу путем культивирования микроорганизмов следующих штаммов: Лс 11 пор 1 апез ппэзоцг 1 епз 1 з МККЬ В, Ас 11 пор 1 апез рЫ 111 ррепыэ АТСС 12427, Ас 11 пор 1 апеэ аппеп 1 асцэ АТСС 15676 и Лс 11 пор 1 апеэ зр. АТСС 23342.Зти микроорганизмы хранят по отдельности в форме исходных культур на пластинках с 1,7 триптона, 0,3 сойтона, 0,25 глюкозы и 2,0 агар-агара. Продукт инокулирования готовят путем переноса исходнои культуры в пробирку с 8 мл стерилизованной среды состава, Оо. триптон 1,7, сойтон 0,3, КНР 04 0,25, глюкоза 0,25, 11 родукт инокулирования культивируют в этой пробирке при 28"С в течение 2 - 3 суток при встряхивании, а затем его вносят в одну из приведенных ниже сред для выращивания и получения изомеризующего глюкозу фермента.Среда Йо 1 содержит следующие компоненты, вес.: триптон 1,3; сойтон 0,3; КяНРО, 0,25; Д-ксилоза 1,0. Ее разбавляют водои до нужного объема. Величину рН среды устанавливают на уровне 7,0, Питательные вещества (например, сахар) перед внесением стерилизуют.Среда Мо 2 отличается от среды Мо 1 тем, что вместо Д-ксилозы вносят 0,25 оД-глюкозы, в нее вносят также жидкость после вымачивания кукурузы (3), сульфат двухвалентного кооальта и сульфат двухвалентной меди. Средой М 3 является барда, средой Мо 4 и т, д, - пептоновый экстракт дрожжей, продукт гидролиза казеина,. продукт гидролиза соевых бобов, продукт гидролиза белков рыб. Готовят среды и из смесей указанных веществ.К выбранной из указанных выше сред прибавляют продукт инокулирования из расчета 5 мл последнего на 75 мл среды с триптоном и сойтоном или на 95 мл среды из жидкости после вымачивания кукурузы,Инкубирование ведут в течение 96 ч при 28"С, среду встряхивают на вибрационной установке. По окончании инкубирования клетки выделяют центрифугированием 30 мл культуральной жидкости при скоро.655327 Удельная активность, полученная при использовании среды Формула изобретения в виде жидкости после вы содер- жащей не содержащей Д-кси- лозу Асппор 1 апез Д-ксимачивания кукурузы лозу а) ппззоцг 1 епз 1 зХКЙ 1. Б б) рЫ 111 ррепз 1 зАТСС 12427в) агвеп 1 асцзАТСС 15676г) зр. АТСС23342 17,8 20,6 15,2 0,29 2,0 0,87 0,82 0,24 0,10 0,41 1,70 0,48 Составитель М. Андреева Редактор Н. Хубларова Техред Н. Строганова Корректоры: 3. Тарасова и Л, БрахнинаЗаказ 572/3 Изд. Хо 248 Тираж 548 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 5сти вращения 15000 об/мин в течение 10 мин, промывают водопроводной водой и суспендируют в 14 мл 0,12 М фосфатного буфера с рН 7,0, Полученную суспензию клеток обрабатывают ультразвуком при 4 С в течение 4 мин, а затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Верхний слой жидкости можно использовать как сырой источник фермента, вызывающий изомеризацию глюкозы.Данные об удельной активности полученной глюкозоизомеразы в зависимости от вида культуры и питательной среды представлены в таблице. Наибольшей активностью отличается глюкозоизомераза, полученная при культивировании Ас 11 пор 1 апез ппззоцг 1 епз 1 з ХКК 1.Вна среде, содержащей Д-ксилозу. 6На качество получаемого фермента оказывает влияние также способ подготовки жидкости после вымачивания кукурузы, Рекомендуется нейтрализацию этой жидко сти вести до рН 7,0 щелочью, а затем еепрофильтровать.При приготовлении питательной средыиз этой жидкости добавляют сульфат двухвалентного кобальта и сульфат двухвалент ной меди с концентрацией соответственно0,1 мМ и 0,05 мМ.Наиболее высокие показатели дает применение гидрата окиси натрия (по сравнению с гидратом окиси кальция и гидратом 15 окиси аммония). 1. Способ получения глюкозоизомеразы20 путем культивирования ее продуцента напитательной среде, содержащей источникиуглерода, азота и минеральной соли, отличающийся тем, что, с целью повышения активности фермента, из микроорга 25 низмов продуцентов используют штаммыАс 11 пор 1 апез пиззоцг 1 епз 18 МК 1 Ц. В,Ас 11 пор 1 апез рИ 111 ррепз 18 АТСС 12427, Ас 11 пор 1 апез аппеп 1 асцз АТСС 15676 и Ас 11- пор 1 апез зр. АТСС 23342.30 2. Способ по п. 1, отличающийсятем, что в качестве источника азота используют или жидкость вымоченной кукурузы, или барду, или гидролизат казеина,или гидролизат соевых бобов, или гидролизат белка рыб, или их смесь.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Великобритании Мз 1280396,кл. С ЗН, опублик, 1972.