Способ получения антибиотика

(,и 655326 Соаз Советских Социалистических Респуолкк(32) 30.10 (33) США Государственный комитет СССРпо делам изооретеи открытий(72) Авторы изобретения ИностранцыКодзи Томита, Кей-ичи фудзисаи Хироси Цукиура(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ А бласт иоти лучения ан он но онсиа1сион 1сионснежок 10 где К - СНзСНаСОХН, СНзСОХН, СНз(СН,)СОКН, КНьотличающийся тем, что штамм Рзецс 1 огпопаз зр. Р 946 - В 83 АТСС 31086 выращивают в аэробных условиях на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при рН 5,5 - 9,5 и температуре 10 - 32 С с последующим выделением целевого продукта в свободном виде или в виде производных солей.Штамм Рзецс 1 отпопаз зр. Р 946 - В 83 представляет собой психрофильную почвенную бактерию, которая была выделена из обр азца индийской почвы. Культу р а этого Изобретение относитсябиологии.Предложен способ пока общей формулы организма включена в Американскую Типовую коллекцию культур (Вашингтон Д. С.) и коллекцию микроорганизмов как АТСС 31086.Штамм Рзецдогпопаз зр. Р 946 - В 83 АТСС 31086 представляет собой строго аэробную, не образующую спор грамотрицательную бактерию. Клетки имеют форму палочек и производят униполярный множественный жгутик. Штамм представляет собой психрофильный организм, развивающийся при температуре 4 С, но не выше 41 С. Он производит флуоресцентный пигмент в глутаматной среде и в растворе снятого молока.Морфологические признаки, Штамм Рзецдогпопаз зр, Р 946 - В 83 представляет собой подвижные не образующие спор грамположительные палочки, клетки прямые, иногда изогнутые вдоль длинной оси и производят униполярные растущие пучком жгутики.Культуральные признаки. Питательный агар с дрожжевым экстрактом. Обильный рост 0,5 - 1,5 мм в диаметре через день, рассеянный, круговой и в некоторой степени рельефный, гладкий. Мицелий непро15 50 дд 60 зрачный, беловатый, внослсдствин цвст его переходит в темно-желтый. Слегка вязки 11. Днффундирующий пигмент не образуется,Питательный бульон и бульон на дрожжевом экстракте. Обильный рост, Мутный. С течением времени может происходить образование осадка и иногда образование пленки.Агар с дрожжевым эксграктом, Рост только на поверхности. В анаэробных условиях роста нет.Ограниченно растет при 4 С, умеренный до обильного наблюдается рост при температуре от 10 до 32 С, плохо растст при 37 С и совсем не растет при 41 С. рН среды от 4,5 до 11,00, нрсдпочтительным является рН 5,5 - 9,5,Добавление МаС влияет на рост; при добавлении 12% ХаС нет роста, умеренный рост наблюдается при добавлении 5% КаС или менее.Штамм Рзеис 1 огпопаз зр, Р 946 - В 83 производит диффундирующий флуоресцентный пигмент в некоторых средах.Антибиотик получают выращиванием штамма Рзеийогпопаз зр. Р 946 - В 83 АТСС 31086 в аэробных условиях на питательной среде, содержащей: источники углерода, например, глюкозу, фруктозу, маннозу, глицерин; способный к ассимиляции источник азота, например, рыбную муку, соевую муку, пептоны; неорганические соли, например, соли натрия, калия, аммония, кальция, фосфата, сульфата, хлорида, бромида, нитрата, карбоната.Температура выращивания 28 - 30 С. рН среды 5,5 - 9,5, предпочтительно 7,0. Выращивание осуществляют в течение 3 - 5 дней.Если фсрментацию проводят в чане, то получают вегетативный прививочный материал в питательном бульоне путем инокулирования бульонной культуры косой или почвенной культурой или лиофилизированной культурой организма. После получения активного прививочного материала его асептически переносят в среду чана для ферментации.Хорошо развившийся на косом агаре штамм Рзеидоптопаз зр, Р 946 - В 83 используют для инокулирования затравочной среды, содержащей, %: глюкозы 3,0; рыбной муки 2,0; соевой муки 0,5; пептона 0,2; СаСО, 0,6. Перед стерилизацией устанавливают рН 7,0. Затравочную культуру инкубируют при 28 С в течение 48 ч на ротационной качалке н 22 мл культуры перс- носят в 100 мл ферментационной среды, находяцейся в 500 мл колбе Эрленмейра, в которой находится, %: глицерина 2,0; льняной муки 2,0; арахисовой муки 1,0; рыбной муки 2,0; (КН 4)г 804 0,3; СаСОз 0,5. Количество антибиотика достигает максимального значения через 3 - 5 дней при 28 С, Антибиотическую активность в фер 5 0 15 20 25 30 35 10 мснтационном б лионе определиот мс 1 одом определения диффузии в системе бум ахкный диск - агар с использованием Вас 111 цз зпЫ 111 з РС 1 219. Получают антибиотика 1500 - 2000 мкг/мл.После получения бульона оптимальной активности устанавливают рН 2, основной водорастворимый антибиотический комплекс отделяют от мицелия и растворяют в водной ферм снтационной среде, Бульон Фильтруют и фильтрат, содержащий антибиотик, нейтрализуют до рН 7 и пропускают через катионообмснную смолу (амберлит в аммониевой форме). Затем смолу промывают водой и разбавляют МН 4 ОН, а антибиотик элюиручот со смолы подходящим элюснтом. Лктивныс порции элюснта объединяют, концентрируют и выпаривают или лиофилизируют с получением антибиотика. При помощи тонкослойной хроматографии получают сырое твердое вещество, которое содержит три активных компонента А, Аг и В, а также два неактивных компонента С и Р.Антибиотик разделяют на компоненты А, Аг, В, С и Р при помощи катионообменной смолы типа Амберлит 6-50 в аммониевой форме, После растворения антибиотика в воде его обрабатывают смолой, промывают водой, разбавляют гидроокисью аммония и элюируют подходящим элементом. 20 н. гидроокись аммония позволяет получить компоненты А и В, дальнейшее элюирование колонны более концентрированным раствором гидроокиси аммония позволяет получить компоненты С и Р. Чтобы получить очищенный компонент Л необходимо осуществить дополнительное хроматографирование на колонке фракции А с целью разделения компонентов Л, и Л,Антибиотичсское вещество А представляет собой белое аморфное основание, растворимое в воде, слегка растворимое в метаноле и этанолс и практически нерастворимое в н-бутаноле, ацетоне и других органических растворителях.Антибиотик А способен образовывать соли при взаимодействии с кислотами. Фармацевтически применимыми являются не- токсичные соли таких органических и неорганических кислот, как хлористоводородная, серная, фосфорная, уксусная, стеариновая, пропионовая, винная, малеиновая, бензойная, янтарная и т. п,Лнтибиотик Л дает положительную реакцию с нингидриновым и антроповым реагентами, но отрицательные реакции с реагсптамн То 1 спз, РеЫ 1 пд и Ьа 1 адцетЫ.Удельное вращение (плоскости поляризации) компонента А в виде основания составляет сс г =78,5. Образец антибиотика А после осажденияиз этанола был подвергнут элементномуанализу, согласно которому вещество имсст фоРмУл СзНзМзО,ХС,НзОНКНзО.Вычислено, %: С 44,24; 1. 8,52; М 9,11; О 38,13.Найдено, /,: С 44,25; Н 8,08;9,11; О (по разнице) 38,56,Ди-Х-ацстат антибиотика А получают в виде бесцветных игл, т. пл. 149 - 150 С, мол. вес. 481 (осмометрическим методом).Вычислено, о/о. С 45,68; Н 7,47, Е 8,41; О 38,44.СоН 3511301 Н 20.Найдено, %: С 45,673; Н 7,49; И 8,19; О (по разнице) 38,59.Антибиотик А представляет собой слабо- основное в "шсство и имеет способные к ги;1 озацио груп:ы, имеющие значения рК, 6,90 и 9,40 в воде. Приблизительный молекулярный вес антибиотика, ца основании вычислений по данным титрования, составляет 398.Антибиотичсскцй компонент А., подобно компоненту А, описанному выше, представляет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в воде, слабо растворимо в метаноле и этаноле и практически цс растворимо в и-бутаноле, ацетоне и другх традиционных расгворцтелях. Оно способно к образованию солей при взаимодействии с кислотами и фармацевтическц применимых солей. Компонент Аз дает положительную нингидрицовую реакцию и положительную антроновую реакцию ц отрицательные реакции при взаимодействии с реагентами То 11 епз, ГеЫпд и Ьа 1 садпсЫ.Для основания А, 1 х, =79,1 (с 0,43, Н.О) . Образец антибиотика А., выделенный в виде карбоната, был идентифицирован как СоНзз 1 зОо Х/зН 2 СОз.Вычислено, %: С 44,79; Н 7,75; М 9,50; О 37,96.Найдено оо. С 44 35. Н 7 83. Х 9 21 О (по разнице) 38,61.Антибиотик В аналогичен по внешнему виду и растворимости антибиотикам А и А. и представляет собой белое аморфное основное вещество, которое растворимо в годе, слегка растворимо в метаноле иэтацолс и практически не растворимо в и-бутанолс, ацетоне и других традиционных органических растворителях.Антибиотик В способен к образованию солей при взаимодействии с кислотами. Даст положительные реакции с нингидрином ц антроцом и отрицательные реакции с реагентами То 11 епв, Ре(пд и Ьа 1 адис 1.Удельное вращение антибиотика В в виде основания составляет сс =85 (с, 1,0, вода).Образец антибиотика В при осаждении из этанола был идентифицирован как С 4 НзоХзОо Х СгНзОН Х НзО,1 О 15 2 О 25 зо 35 40 45 50 55 60 65 Вычислено, о/о: С 42,95;О 39,35.Найдено о/о С 42.69 Н 7.78;8.86; О (по разнице) 40,67.Ди-Х-ацетат антибиотика В получают в виде бесцветных призм, т. пл, 159 - 162 С, мол. вес 484 (методдмц осмометрци).Вычислено, ",: С 44,53; Н 7,27; М 8,66; О 39,54.СзНзззОХНзО.Найдено, о/о С 44,96; Н 7,44; К 8,52; О (по разнице) 39,08.Антибиотик В представляет собой слабое основание и имеет способные к тптрованию группы со значениями рКо 7,15 ц 9,35 в воде. Как было вычислено цз данных тцтровдцця, прцолцзцтсльный молскглярцыЙ всс антибиотика составляет 409.Биологически нсдктпв ый дтибцотч "- скгй компонент Р представляет собой ослос аморфное основнос всщсство, которос растворимо в воде, слабо растворцмо в метаноле и этанолс ц практически нсрастворцмо в н-бутанолс, ацетоне ц других традиционных органических растворителях,Вещество Р способно образовывать соли прц взаимодействии с кислотами.Компонент Р дает положительные реакции с нпнгцдрццом и антроцом, но отрицательные реакции с реагецтамп То 11 епв, Ге 111 пд ц Яа 1 ао 1 с 111. Удсльнос вращение компонента Р в вцдс основания составляет я 11 =72,5 (с 1,0, вода).Образец компонента Р, выделенный в вцдс карбоната, был идентифицирован как С з Нз-,МзОзхНзСОз.Вычислено, %: С 38,70; Н 7,25; Х 10,42; О 43,63.Найдено, /о. С 38,86; Н 6,93; М 10,14; О (по разнице) 44,07.Компонент Р представляет собой слабое основание и имеет трц способныс к т;трованцю группы с величинами рКо 6,95 (2 эквивалента) и 9,68 в воде.Три-М-ацстат компонента Р получаот в вцдс бесцветных призм, т, пл. 159 в 1 С. Эта соль оказалась идентичной дц-М-ацетату компонента В,Определение стрктры коз:поцснтов ЛВМягкий кислотный гцдролиз компонентов А и В дает такое жс дезаццльцос соединение СзНз 7 ХзОз, которос идентично 1 омпоценту Р, полученному хромдтографцческцм разделением сырого комплекса антибиотика. Общее М-ацетцлирование антибиотика Дало тРи-М-аЦетат (СзНззз 011), котоРый был 1 дентфнцировац как дц-.Ч-ацстаткомпонента В.Кислый гцдролиз компонента В в метацольном растворе хлорцстоводородной кислоты (насьпценный раствор, тсмпсратура начала стекднця флсгмы, 24 ч) приводит к получению агликона и амипосахарасовместно с компонентом Р. Агликон выделяют в виде кристаллического сульфата,т. пл. 263 - 264 С, который был идентифицирован как СНдМО,Н,БО 4 5Вычислено, %: С 25,90; Н 6,52; К 10,07;8 11,52,Найдено, %: С 26,10; Н 6,47; И 9,93;Я 11,29.ЯМР-спектр, снятый при 220 МНгХ, 10о-гексаацетата этого вещества совместно сданными масс-спектрального анализа, полученными при использовании М-ацетил-оТМЯ К-ацетил-диизопропилидена и гексаК-о, Х-ацстил производных агликона, позволяет предположить 1,4-диамино,3,5,6 тетра-ольную структуру для агликоновойчасти.Ди-К-ацетат агликопа получают в видебесцветных игл, т. пл. 114 - 115 С. 20Вычислено, %: С 45,45; Н 7,63; М 10,60.СНд,МдО.Найдено, %: С 45,37; Н 7,97; М 10,57.Лмнносахарный фрагмент, полученныйпосле описанного кислого метанолиза компонснта В, очищают хроматографированием на Амберлитс 6-50 и разделяют на аи -формы метилгликозида, причем а-форма - основной продукт. К-ацетилированием а-метилгликозида получают вещество в Зпвиде бесцветных призм, т. пл, 185 - 186 С.Вычислено, %: С 45,95; Н 7,28; Х 5,95.СдНпХОд.Найдено, %: С 45,93; Н 7,43; К 5,88.Масс-спектр этого Х-ацетильного произ- ззводного дает пик при т/е 204 (М - 31), соответствующий потери молекулой гликозидной метоксильной группы. Таким образом, свободный аминосахар должен иметьформулу СдНАО,. 40а- и р-формы мстплгликозпда идентифицированы как метил-амино-диокси-а- ир-Р-глюкопиранозид соответственно в результате снятия ИК- и ЯМР-спектров ихтетра-К, о-ацетилпроизводных. ИК-спсктры .дискусственных образцов этих сахаров, выделенных из 4-трехалосамина, соответствуют ИК-спектрам экспсримснтальных образцов.Кислый гидролиз компонента 0 даст те 50же самые агликон и аминосахар, что быливыделены из гидролизата компонента В.Компонент С, полученный хроматографическим разделением сырого комплекса антибиотика, подвергают гидролизу в средеметанола, содержащего 1 н. НС 1, при температуре стскания флегмы в течение 3 ч.Агликоновый фрагмент идентичен этой части в других компонентах антибиотика, ифрагмент сахара идентифицирован как метил Р-глюкозид с помощью тонкослойнойхроматографии, ЯМР- и хроматографии.В опытах 1 п Юго показано, что антибиотик и индивидуальны аптибготичсскиекомпоненты ЛД. и В обладаю 1 гцироким иб спектром антибактериальной активности. Антибиотик и активные компоненты ингибируют большинство аминогликозидустойчивых организмов. Обнаружено, что компонснт А, является более активным по сравнению с компонентом В, но менее активен чем А.Чинимальпую ингибирующую концентрацию А и В определяют по отношению к большому количеству бактерий способом двукратного разбавления агара в чашках с питательным агаром. Для этой цели используют иноколумрепродуцирующее устройство. Количество прививочного материала поддерживают таким, чтобы оно составляло разбавление в 10" раз оставленной на ночь культуры испытуемых организмов в ссрдце-псптонном бульоне (ангес).Удельные активности компонентов А и В умеренные или достаточно слабые в отношении значений минимальной ингибиторной концентрации (МИК), причем компонсн А в 2 - 4 раза более активен, чем В. Однако опи имеют широкий спектр анти- бактериальной активности против грамположительных и грамотрицательных бактерий, включающих многие аминогликозидустойчивые организмы и штаммы.Установлено, что антибиотик с чистотой 30 - 40% ингибирует Е. со 11 А 20365 при концентрации 12,5 мкг/мл, К. рпецгпоп 1 ае Рпри концентрации 1,5 мкг/мл, и Рз. асгоп 1 поза А 9930 при концентрации 25 мкг/мл.Влияние рН на МИК.Влияние рН среды на МИК компонента А изучают методом двойного разбавления агара с использованием среды питательного агара при рН 6,0, 7,0, 8,0 и 9,0. Результаты показывают, что активность компонента А увеличивается в среде с щелочным рН и уменьшается в среде с кислым рН.Влияние среды на активность компонентов Л и В изучают по отношению к 8-ми испытуемым организмам. В качестве испытуемых сред используют питательный агар, ссрдце-псптонный агар и Мпе 1 ег-Н 1 п 1 оогар. рН среды устанавливают 8,0, Наибольшая активность 1 п и 1 го проявляется при использовании в качестве испытуемой среды питательного агара.Активность и токсичность компонентов А и В оценивают 1 п ювао при экспериментальном заражении мышей, В качестве патогенных бактерий используют 8. апгецз впаяй, Е. со 111 Ш и Рз. аегорпоза А 9930. Мышей заражают 100 Х 40 ьд дозой патогснов в 5%-ной суспензии желудочного муцина свиней, единичное подкожное введение антибиотика осуществляют немедленно после б актер иального заражения (О ч) и двойную дозировку антибиотика вводят через 0 пли 3 ч после заражения, Для каждого дозировочного уровняисполь2,7 А+ В (небольшое количество)В 7,8 4,4 3,3 5 о зуют группы в 5 мышей, и животных наблюдают в течспие 5-ти дней для определения средней защитной дозы .)ы,Компоненты А и В проявляют активность 1 п цгчо против всех трех испытуемых бактерий.Остру)о токсичность компонентов А и В определяют на мышах при подкожном и внутривенном применении. Мышей наблюдают в течение 15-ти дней. Внутривенная (1, х.) и подкожная (з.е.) .)з, компонента А составляет 2500 мг/кг и 1000 мг/кг соответственно. Компонент В значительно менее токсичсн, чем А, и не вызывает смертсл; ного исхода при дозировках вплоть до 2000 мг/кг как при внутривенном, так и при подкожном применении в течение 15- дневного периода наблюдения.Компонент Р, хотя он и является биологически неактивным, представляет собой ценное промежуточное вещество в полусинтетическом получении биологически активных компонентов А, А, В. Так, например, свободная ам иногруппа промежуточного вещества ) (после соответствующей защиты других реакционноспособных функциональных групп) может быть подвергнута К-ацилированию в соответствии со способами, известными рег зе, с образованием (после удаления любых защитных групп) 1 х 1-бутирильного производного А, 1 х 1-ацетильного производного В и 1 х-пропионильного производного А,.П р и м е р 1, Ферментация в чане.Штамм Р 946-В 83 культуры Рзецдотпопаз на косом агаре используют для инокулирования 100 мл затравочной среды83 В (3% глюкозы, 2% рыбной муки, 0,5% соевой муки, 0,2% пептона и 0,6% СаСО,) в 500 мл колбах Эрленмейра. Колбы инкубируют при 28 С в течение Здней на ротационной мешалке (250 об/мин), и используют 1 л затравочной культуры для инокулирования 300 л ферментационной среды100 (2% глицерина, 1% Р 1 аггпапсйа, 2% рыбной муки, 2% муки льняного семени, 0,3% (чН 4)гс 104, 0,6% СаСОз) Ферментацию в чане проводят при 30 С, перемешивании со скоростью 140 об/мин, при скорости аэрации 200 л/мин. Активность бульона определяют методом бумажный диск - пластина агара с использованием В. зцЫ 111 з РС 1 219 в качестве образца для анализа и ВИ 2183 А - в качестве стандарта для анализа. Полученные результаты представлены в табл. 1.П р и м е р 2 (экстракция). Созревший бульон фильтруют при рН 2. Фнльтрат (19 л), который содержит около 30 г антибиотика А, доводят до рН 7 и перемешивают с 13 л Амберлита .КЬ(ХН+-форма). Смолу отделяют, промывают 10 л воды и 5 л 15 н. МН 4 ОН, затем перемешивают с двумя 4-литровыми порциями 2 н, 1 хН 40 Н для элюирования. Активные,элюа 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Время, ч рН бульона ты объединяют, концентрируют в вакууме и затем лиофплизируют с получением 18,6 г белого твердого вещества (около 700 мкг/мг), Это твердое вещество растворяют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом 6-50 (ХН 4+-форма, 400 мл). Колонку промывают 2,2 л воды и 3 л 4 н. ХНОН и затем элюируют 20 н. 1 ХН,ОН. Элюаты собирают по фракциям и исследуют методом биологического анализа на пластине с В. зцЬИ(з, а также методом тонкослойной хроматографии (система Б, нингидрин).Соответствующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лпофплизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл, 2,П р и м е р 3, Получение компонента А.Сырой образец компонента А (2,7 г), полученный в примере 2, растворяют в воде и пропускают через колонку с Амберлитом 6-50 (ХН 4+, 80 мл). Колонку элюируют 20 н. 1 хН 40 Н и каждые 15 мл элюата собирают при помощи фракционного сборника. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) и реакцией на нингпдрпн, а также биологическим анализохи Саответса вующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ.Результаты представлены в табл, 3.Чистый препарат компонента А идентифицирован как С 1 зНз 1 Хз 09 Х/Н СОз.Вычислено, %: С 43,45; Н 7,53; х 9,81, Найдено, %: С 43,22; Н 7,52; Х 9,49.1,638 П р и м е р 4. Получение компонента В.Сырой образец компонента В (3,3 г), полученный в примере 2, растворяют в воде и пропускают через колонку с Амбер литом (л(ИН 4+, 130 мл). Колонку элюируют 20 н. ИН 40 Н, и каждую порцию элюата - по 15 мл - собирают фракционным сборником. Фракции исследуют методом тонкослойной хроматографии и реак цией на нингидрин, а также биологическим анализом, Соответствующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ. Результаты представлены в табл, 4, 25 526 А 2 0,57 0,48 Таблица 4 Вес твердого веще.ства, мг Номер фракцииВ в , примесиВ онг т нн снон но он В+примеси (небольшое количество)1сн,он 40 где К - СНзСНзСОКН, СНзСОИН,СНз (СНз) зСОКН) ИНз,отличающийся тем, что штамм Рвепг 1 огпопаз зр. Д 946 - В 83 АТСС 31086 выращивают в аэробпых условиях на среде,содержащей источники углерода, азота иминеральные соли, при рН 5,5 - 9,5 и температуре 10 - 32 С с последующим выдсле 50 нием целевого продукта в свободном видеили в виде производных солей. Составитель С, Малютина Техред Н, СтрогановаРедактор Н. Хубларова Заказ 187/16 Изд. М 225 Тираж 548 Подписное НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж.35, Раушская иаб., д. 4/5Типографии, ир. Сапунова, 2 Чистый препарат компонента В идентифицирован как С 14 НюИзОзХ/2 НзСОзВычислено, %: С 42,02; Н 7,30; К 10,14.Найдено, %: С 41,92; Н 7,43; М 9,93.П р и м е р 5. Получение компонента С и компонента Р,Колонку, используемую в примере 2, далее проявляют 1,4 л 20 н. КН,ОН, в результате чего не происходит элюирования биологически активного вещества. Затем колонку проявляют 10 н, КН 40 Н, и элюаты исследуют методом тонкослойной хроматографии с опрыскиванием нингидриновым реагентом. Соответствующие фракции объединяют, концентрируют в вакууме и лиофилизируют с получением твердых веществ, Результаты представлены в табл. 5,П р и м е р 6. Получение компонента А.В ходе процесса очистки компонента А, описанного в примере 3, выделяют активный компонент из предыдущих фракций, который обозначен как компонент А 2. Его отделяют от компонента А системой для тонкослойной хроматографии 5-117 и Я. Результаты представлены ниже:А5-117 0,49Я0,39 Способ получения антибиотика общейформулы