Способ выделения гликозидаз

(бц дополнительное к зи миа ВУ Заявлено 10,03,77 (2 Ц 2461735/23 04рнсоединеиием заявки % ЦМ, Кл, С 07 9 7/02 Гааударетвваный ка СССР па делам кзобрвтв и аткрыткйОпубликовано 25.03. 79.бюллетень а опубликовании описания 28,03 Авторыизобретен А, Артюков и Н, В. Молодцов ихоокеанский институт биоорганической хим альневосточного научного центра АН СССР(54) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗИДА Изобретение относится к способам выделения высокоочишенных ферментных препаратов, в частности к способам выделения гликозидаз из обьектов животного . происхождения. Получаемые описываемым способом препараты могут найти примене ние в пищевой и микробиологической промышленности, в лабораторной и медицинской практике, а также могут быть исполь. зованы в научных целях.В настоящее время описано большое число способов выделения ферментов из различных источников. Сравнительно новым является метод очистки, называемыйгидрофобной хроматографией. Синтетические сорбенты для гидрофобной хроматографии получают алкилированием или арилирсванием гидрофильных полимеров, например агар озы Щ,Принципы метода гидрофобной хроматотрафин основаны на различиях в силе гидрофобных взаимодействий между гидрофобным сорбентом, выделяемыми ферментами и применяемыми растворителями. Из1 наиболее распространенных сорбентов для метода гидрофобной хроматографии белков и ферментов пригодны октилсефароза СЬВ и фенилсефароза СЬВ, получаемые указанным методом.Из ранее известных методов выделения гликозидаз наиболее близким к предлагаемому является способ выделения гликозидазы из пасты Е,соРт методом гидрофобной хроматографии на пропиламиноагарозе 2 .Указанный сорбент получают путем ковалентного присоединения пропиламина к бромцианактивированной сефарозе 4 В, Адсорбцию лизата Е, сой обычно проводят в 001 М трис-ацетатном буфере, рН 7,1, содержащем 0,6 М хлорнстый натрий, 0,01 М хлористый магний, 0,01 М ф -меркаптоэтанол и 0,4 М сульфат аммо- ния, а элюцию ферментов с хроматографнческой колонки осуществляют линейным уменьшением концентрации сульфата аммо ния в том же буфере. Используя в качестве гидрофобного сорбента пропиламиноага-гапактоэидазу иэ экстракта Е. соИ с выходом 60%,Однако известный способ выделения иочистки гпикозидаз методом гидрофобной 5хроматографии на пропипаминоагарозе непозвопяет одновременно выделить полныйнабор гпикозидаз из пизата Е,со 6 а дает возможность, получить толька один представитель этого класса ферментов - ,Э - 1 О-гапактоэидазы не является однородным,а содержит дополнительно два других бепка, что снижает эффективность выделенияи степень очистки, Кроме того, испопьзуемый сорбент, пропипаминоагароза, непригоден дпя многократного примененияиз-аа лабипьности й -ацилзамещеннойимидокарбонатной группы в присутствиисильных нукпеофипьных буферных систем, 20испопьзование которых необходимо дпярегенерации сорбента.,Цепью изобретения является разработка нового способа выдепения и очисткигпикоэидаз методом гидрофобной хроматографии дпя одновременного получения попного набора этих. ферментов, повышенияих ферментативной активности и чистоты.Дпя достижения укаэанной цели гпикозидазы выделяют из обьекта животногоЗопроисхождения (печень морского мопюска Асеаеа раИМа ) с использованием вкачестве избирательного гидрофобногосорбента 2-И -бензоипамидогептипамино-окси-симм-триазинипагарозы, П оспед 35нюю попучают несложным четырехстадийным синтезом через активацию сефарозы4 В трихпортриазином, Высокая избиратепьность связывания и большое сродст 40во гпикозидаз к 2-И -бзнзипамидогептипамино-окси-симм-три азинипагарозе(10-15 мг ферментов на 1 мп сорбентаупозволяют методом гидрофобной хроматографии одновременно выделить полный4набор этих ферментов и осуществить их30-кратную очистку непосредственно изэкстракта тканей животного происхождения с выходом 62%.5 ОПредлагаемый способ выдепения гпикозидаз методом гидрофобной хроматографии, поэвопяющий проводить одновременное выделение полного набора гпикозидаз с высокой ферментативной активностью и чистотой, заключается в том, что экстракт ферментов из объекта животного происхождения (печень морского моллюска Асгщэеа раИИа ) подвергают хроматографии на 2-И -бенэоцпамипогептппаминь 4-окс 1 л-симлл-триазинипагароэе,Предпочтитепьно процесс выдепениягпикозидаз из укаэанного объекта проводить спедуюшим образом. Лдсорбцию гликозидаз на 2-И -бенэоипамидогептипамино-окси-силлм триаэинипагароэе ведутв 0,05 М фосфатном буфере, рН 4,0 -6,5, желательно рН 5, а эпюацию ферментов с хроматографической копонки осуществпяют с использованием 50%-ногораствора этипенгпикопя в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0, содержащего 1 Мхпористый натрий. Органический растворитепь (этипенгпикопь) и избыток хлористого натрия из препарата гпикозидаз уда-пяют гепь-сипьтрацией препарата на сефадексе Г.П р и м е р. Гидрофобная хроматография, 7 г сырой печени морского моппюска Ас гдаеа рай Рда гомогенизируют в35 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 5,0,Осадок центрифугируют при 6000 об/мин иотбрасывают, Надосадочную жидкость попкиспяют разбавпенной соляной кислотой.до рН 4,0 при 0,2-1,5 С, выдерживаюто10-15 мин при этой температуре и выпавшие белки удаляют центрифугированием,Полученные 30 мп экстракта гпикоэидаз-ацетип-Р -гпюкозаминиду) доводят дорН 5,0 и хроматографируют на колонке с2-И -бензои памидогепти памино-окси-симм- триаэинипагарозой. Раствор гпикоэидаз пропускают через колонку (0,8 хх 10 см)с гидрофобным сорбентом, промывают исходным буфером до полного удапения несорбированного белка, а затем раста.вором этипенгпикопя с линейным градиентом (О% по объему) в 0,05 Мфосфатном буфере, рН 5,0,Гпикозидазы эпюируют с колонки 50"Уным раствором этиленгпикопя в 0,05 Мфосфатном буфере, рН 5,0, содержащем1 М .хпористый натрий.Обессопивание и удаление органического растворителя. Во избежание инактивации гпикозидаз эпюированный раствор феГ- ментов быстро хроматографируют на копонке с сефадексом Г, уравновешенной: 0,05 М фосфатным буфером, рН 5,0.Характеристика препарата гпикозидаз. Таким образом выделяют 4,8 мг гпикозидаз с удепьной активностью по 11 -нит рофенип-И л петий ф -В-гпюкоэам вниду