Способ получения лизосомального полиферментного препарата для лечения инфицированнных очагов

Союз Советских Социалистических Республик(22) Заявлено 11.09.75 (21с присоединением за 5 вки д-ву 66051/13 61 К 37/48Гасударственный намнтет Саввтв Мнннотров СССР ао долам иэооретений и открытий) СПОСОБ Г 1 ОЛУЧЕНИЯ ЛИЗОСОГЧА.ГБНОГО Г 10111 ФЕРМЕН 11.Г ГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФ 1 Ш 1 РОВА.Н 1 Х ОЧАГОВ Цельюпособа в зоор ге елецця ГЯ ЯИГ 5 Т(.Я ИР.1 ИИ 1 ДЛЯ ПОЛУЧ 1 ИГЯсостоящего изииГских ферцой сщ иифичшзосо; олифрл(енгцого препарат рцродцо ецтов с о комплекса гидре субе тра различ цо РУ(сплавления не тизированць х очищения е остью, Это д ур различных тка игаегсялизосом ИЕЛ 1 СИОЕОГ РИМ 1 Ц.5 КИЮЧвыделив зацию б субкл 5(.ку фтаки ного по.нцфициро его гол огеии О 1 ОГГСКОц; стру(ги л гзосол О Л 1:.1Е 1 У5ги 1, ДЛ 5 И 51 И,.1.11, 1;К 1 ЦИГфрмецтного ир иаваццых очагов,В качестве и гочцик азлич ые свжеиолучеиць сецьскохозяйств о скота, свиий ов ГОРЦЫХ жИВОТЦЬ 1 Х Ктаю рогато табора некого рыб; б рых вилов птиц (ку ЕСЦОЗ ВОЦОЧ 1 ЫХ; е некогоГе 1 кани аугоисийый лагроб иолучеция лизе(. тцого 5 репарата дл 5 ипиды, гликопрориды, мукополисахариды теиды и др,),. остаются Кроме этого, ферменты, ит препарат, инактивиру еразрушеццымн.из которых сост ЛОВК 1ц,Ии"111)Г,и переварива альцого и(си - счеция иифициру ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ А. Покровский, В. А. Тутельян и Л, В. Кравченко титут питания Академии медицинских наук СССР Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения новых лечебных средств, предназначенных для энзимаг ческой обработки инфицированных очагов в Известен способ получения фермецтцого репарата, пригодного для лечция Гц 1 ицГ- ровацных очагов заключающийся в том, что 10 з биологического материала (.шгамм микоорганизмов) выделяют и подвергают о иске комплекс протеолитическнх ферментов11,Однако препарат, полученный известным пособом, недостаточно эффективен, так как 1 следствие ограниченной субстрагной спеифичности приводит лишь к частичной дегадации белков. В то же время другие макомолекулярные соединения, входящие в остав некротизированной ткани (полисаха ИЗОСОЛ ИСИО.1 Ь,ИУ(1Е ТК:ГИИ Л:ГКОИИ -ии 1,х (круиисгоец, лои(адей) иро.Гиков, кь 1)уток, гусе 1);ГйШИХ и Р.1 Тицй,рованных очагов поясняегся следуюшим примером,П р и м е р. 1 кг свежеполучецной пе 1чени крупного рогатого скота промывают вохлажденном физиологическом растворе, измельчают путем продавливания через перфорированную пластину из нержавеющей стали(пресс с диаметром отверстий около 1 мм)и гомогенизируют в цилиндрическом, гладкос- .тенном стеклянном гомогенизагоре с фторопластовым пестиком (зазор 0,21 - 0,23 мм)при 1500 об/мин в течение 120 сек, Вкачестве суспендируюшей среды используютизотонический 025 М раствор сахарозы с0,001 М ЭДТА (рН 7,4), Разведение ткани 1;9.Гомогенаг фильтруют через нейлоновыйфильтр и оставшиеся на фильтре неразрушенные компоненты ткани регомогенизируют втом же объеме среды, Осаждение субклеточных структур осуществляют с помощью дифференциального ценгрифугирования, используя для этого угловые роторы большогообъема или роторы непрерывного действия.Объединенный фильтрат центрифугируют при3500в течение 10 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость вновь "ценгрифугируют в течение 30 мин при 10000для выделения лизосом. Полученный осадок(лизосомы) ресуспендируют в 9 л среды иповторно ценгрифугируют при этих же условиях. Дополнительное обогащение фракциилизосом и ее очистку осуществляют с помощью ценгрифугирования суспензии лизосомв градиенте плотности среды (сахарозы,35фиколла) в роторах с поднимающимися пробирками или роторах зонального типа, Дляочистки лизосом от низкомолекулярных соединений плотный осадок осторожно заливают охлажденным физиологическим раствором 40и промывную жидкость быстро удаляют, Этупроцедуру повторяют, используя в качествепромывной жидкости бидистиллированную воду. Дополнительную очистку осушествляютпутем диализа ресуслендированного осадка 45против воды. Для получения лизосом с различной степенью повреждения мембран полученный осадок гшательно ресуспендируюг в1 л физиологического раствора, после чегоподвергают поэтапному замораживанию (при-20 С) и оттаиванию (при +20 С). В зависимости ог количества повгорейий этойобработки достигается различная степеньповреждения (" Раскрытия" ) лизосомальныхмембран, Для получения лизосом с полностью 5разрушенной мембраной полученный осадокресуспендируют в 1 л бидистиллированной,воды и замораживают при -20 С, Процеду.ру замораживания и оттаивания повторяютне менее 8-10 раз, после чего суспензию бО 4сразу же подвергают л 1 офилизации. Для получения высокорастворимой разновидности лизосомального полиферменгного препарата суспензию лизосом с полностью разрушенной мембраной предварительно ценгрифугируют при 100000 у в течение 30 мин для осаждения мембран и лиофилизации подвергают надосадочкую жидкость, содержашую растворимые ферменты матрикса лизосол.Для увеличения выхода препарата осадок, со - держаший лизосомальные мембраны, вновь ресуспендируют в бидистиллированной воде и лиофилизируюг. Высокорастворимую разновидность лизосомального полиферменгного препарата перед лиофилизацией подвергают стерилизации путем фильтрации через ульграмикролорисгые мембранные фильтры, Для получения разновидностей лизосомального полиферментного препарата в сусле зию или раствор перед лиофилизацией добавляют расчетное количество необходимого дополнительного химиотерапевтического средства ( антибиотики, сульфаниламидные препараты и др.). Полученный после лиофилизации порошок расфасовывают в стерильные стекянные флаконы и закупоривают, Выход препарата составляет около 20 г (в расчете на сухой вес); высокорастворимой разовидности препарата - около 3 г.Хранить полученный лизосомальный полиферменгный 1 грепарат и его разновидности необходимо в лиофилизированном сосгоянии в герметических стеклянных флаконах при температуре - 4 - -8 С. При хранениио ов этих условиях активность препарата практически не изменяется в течение 8-10 лесяцев.С целью увеличения содержания лизосом в исходном материале вызывают индукцию их образоваия и биосинтеза лизосомальных ферментов путем предварительного воздействия на животньс помошью различных элементарных факторов (голодание, содержание на малобелковом рационе и др.).Лизосомаьный полиферменгный и репарат может быть использован в клинике для эпзиматической обработки инфицированных очагов в целях расплавления некротизированных струкгур различных тканей и их оч 1 щеия. Полиферменгный препараг и его разновидности могут быть применены при лечении гнойных ран и ожогов, хронических незажи - вающих язв; при лечении травматических и послеоперационных ге атом, осгеоие,итов, абсцессов; при пневмококковых и туберкулезных менингитах (путем вугр 11,юл- бального введения въсокорасгворидой разио - видности препарата)11 ри различых заболс ваниях дыхательных путей-бронхитах, броихоэк газах, аб сцессах легких, груднораз ре10 Составитель С. МалютццаТ од М, Цупа КорректоР Л. Власенко Редактор М. Рогова Заказ 3403/10 Тираж 677 Подписцое ЦНИИПИ Государственный комитет Совет Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская цаб., д. 1/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. П 1 ооктця 1 шающихся пневмониях и агелекгазах хронической бронхиальной астме и эмфиземе; в стоматологии - при лечении гангрен корня зуба, при воспалении десцевых карманов, парадонтозах; в офтальмологии - при лечении коньюнктивитов; в отоларингологиипри лечении воспалительных заболеваний носоглотки и среднего уха; в дерматологии, гинекрлогии и других областях медицины.Преимушеством лизосомальцого полиферментного препарата является то, что в состав его входят все ферменты, цеоьходимые для полной деградации любого из известных биополимеров, причем эти ферменты устойчивы по отношению друг к другу,форлула изоб ре гения Применение способа выделения лизосом включающего гомогенизацию биологическог о материала, осаждение субклеточцых структур, выделецие и очистку фракции лизосом для получения лизосомальцого полифермоцтного препарата для лечения инфицированных очагов,Исгочцнки инфорлации принятые во внимание при экспертизе: 1. агент СШЛ Ид 3409719, кл, 42:115 94, 1968