Способ получения полипетидов, содержащих аспарагил глициновую последовательность

.05.72 Гасударственные комите Совета Министров СССР ло делам изобретенийи открытий бликовано 28,02.76. Бюллетень(72) Авторы изобретени ИностранцыЛайош Кишфалудь, Миклош Лев, ИштванМария С. Шаркези, 1 Иандор Вайюс, Андрттила Юхас, Кальман Медзихрадски, Ласл(ВНР) Лен, Тамаш Сиртеш, ш Туран, Рожа Беке, Спорни и Ласло Гра 1) Заявител Иностранное предприят тер Гедеон Ведьесети Д) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ АС ПАРА ГИЛ ГЛ И ЦИ НОВУЮ ПОСЛ ЕДО ВАТЕЛЬ НОСТЬ Изобретение относится к усовершенствованию способа получения полипептидов, содержащих аспарагилглициновую последовательность,Предлагаемый способ может быть применен при синтезе большого числа важных природных полипептидов, содержащих вышеуказанную последовательность, а также для синтеза пептидов, содержащих остатки аспарагина.Известен способ получения пептидов, содержащих аспарагилглициновую последовательность, заключающийся в том, что Х-защищенный пептид, содержащий на С-конце остаток аспарагина и С-защищенный пептид, содержащий на 1 ч-конце остаток глицина, конденсируют методом активированных эфиров, используя в качестве активированного эфира и-нитрофениловый эфир.Недостатком известного способа является необходимость применения защиты для амидной группы аспарагина и наличие стооочных резекций, в результате которых происходит либо перегруппировка а-аопарагил-глицина в р-аспарагилглицин, либо образуется сукцинимидопроизводное, что приводит к очень низкому выходу целевого продукта ( 10% ). Недостатки устраняются путем использования в процессе создания пептидной связи в качестве активированного эфира пептафторфепилового эфира соответствующсго М-защищенного пептида.Предложен способ получения полппег,тядов, содержащих аспарагинилглицпновую последовательность, путем конденсация соотвстствуюших защищенных пептидов методом ктивированпых эфиров и последующего отщспления защитных групп, причем карбок.: и:- ная группа 1 ч-защищенного пептида активируется путем превращения ее в пентзэфо 1 и 11 с 11 пловый эфир обработкой пептафторфепо,д:1;. з присутствии Х,Х-дициклогсксилкарбодпимпда и полученный активированный эфпр коппс сируют с С-защищенным пептядом при эквпмолокулярном соотношеип реагирующих веществ.Использованные в примерах сокращения приняты Л.1 РАС - П)В. Кроме указанных сокращений введены следующие: используемый символ указывает на часть последовательности с числами и далее Х-терминальные и С- терминальные защитные группы. Защитные группы боковых цепей содержатся в дсйствуюгцем заглавном слове, Используются затем следующие сокращения: РСС-дициклогексилкарбодиимпд, Р).РОН - пептафторфенол, РСРОН-пептахлорфенол, РСНЛ - дициклогексил а мин.Определение температур плавления проводилось с помощью прибора доктора То 11 о 11 Вцспс.Тонкослойная хроматография проводилась на силчкагеле на стали при использовании следующих систем растворителей.1, Этилацетат - (пиридин - уксусная кислота - вода=20: 6: 1) =95,5;2, Зтиляцетят - (пиридин - уксусная кислота - вода=-20: 6: 11) =9,1;3. Зтилацетят - (пиридин - уксусная кислота - вода=-20: б: 11) =4: 1;4. Этилацетат - (пиридин - уксусная кислота - вода =20: 6: 11) = 3: 2;5, Этилацетат в пиридин в уксу кислота - вода = 240: 20: 6; 11;б. Этилацетат - пиридин - уксусная 1 кислота - вода=120: 20: б: 11;7. Этилацетат - пиридин - уксусная кислота - вода=60: 20: 6: 11;8. Зтилацетят - пиридип- в уксусн кислота - вода=ЗО: 20: 6: 11;9. Этилацетат - пирндин - уксусная кислота - вода=480: 20: 6: 11;10. Хлороформ - гексан - уксусная кислота=8: 1: 1;11. Хлороформ - метанол=98: 2;12. Хлороформ в метанол=:5;13. Хлороформ - метанол =9: 1;14. Хлороформ - метанол = 85: 5;15, и-Вутанол в пиридин в уксу кислота - вода=30: 20: 6: 24;16. Хлороформ - метанол - уксусная кислота=8:1:1,Для проявления применяется нингидрин и (или) хлор+толидин.П р и м е р 1, Синтез человеческого АСТН зь С тп е с ь 1. 1. - Лгд (КО,) - Агд(ИО) Рго - ОРДЕР (е - 17 - 19 - ОР 1.Р) .3,26 г (5 м моль) 1. - Лгу (ИО,) - Лгд (ХО,) - Рго - ОН растворяют в 30 мл диметилформамида и к раствору добавляют 5,31 г (7 ммоль) РСС - РРРОН-комплекса. Реакционную смесь 5 чяс перемешивают при комнатной темперят ре, затем отфильтровывают выпавший в осадок РСС и фильтрат упаривают до сухого остатка. Маслянистый остаток обрабатывают эфиром, отфильтровывают и промыв аот эфиром, Сырой продукт растворяют в 11 мл тетрягидрофуряна и высаживают с помощью 60,мл эфира. Выход 3,42 г (83,6%) " - 17 - 19 - ОРГР; Е 6 0,55,Сз 1 Нэ 60 иИ 11 Р 5 (817,9).Вычислено, %: С 45,5; Н 4,4; К 18,8; Г 11,6.Найдено, %: С 46,0; Н 4,7; М 18,7; Р 11,8.С т у п е н ь 2, 1. - Агд(ИО,) - Агд(КО,) -- Ча 1 - 1.уз (ВОС) - Ъа 1 - Туг - (1 гВц) Рго - ОН (1. - 17 - 24 - ОН).2,22 г (2,92 ммоль) Н - Ча 1 - 1.уз(ВОС) - Ча 1 - Туг - (гВц) - Рго - ОН суопендируют в25 мл диметилформамида и при перемешивапии добавляют 1,64 г (3,22 ммоль) 1. - 17 - 19 - ОРДЕР.Через 2,5 чяс получают прозрачный рас твор, который перемешивают еще 2,5 час изатем упаривают до сухого остатка, Остаток суопендируют в тетрагидрофуране, отфильтровывают и промывают тетрагидрофураном. Сырой продукт растворяют в 15 мл метанола и 10 высажигают с помощью 100 мл этилацетата.Осадок отфильтровывают и сушат. Выход 3,55 г (87,2%) 1. - 7 24 ОН. Я 407СН 990,8 М 7 (1394,61) .Вычислено, %: С 55,1; Н 7,2; И 17,1.Найдено, % С 55,0; Н 7,0; К 17,2.Ступень 3. Н - Агд - Лгд - Рго - Ча 1 -1.уз (ВОС) - Ча 1 - Туг (гВц) - Рго - ОН ЗНС 1 (Н - 17 - 24 - -ОН ЗНС 1). бэ 20 25 30 35 40 50 Г,.60 0,4 г (0,29 смоль) 1. - 17 - 24 - ОН растворяют в 8 мл уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 0,1 г Рс/С. Прохождение реакции контролируют с помощью тонкослойной хромятографии, По окончании реакции отфильтровывают катализатор и фильтрат выпаривают до сухого остатка. Маслянистый остаток растворяют в 3 мл метанола и при охлаждении доводят рН до 4 с помощью НС 1. Затем раствор упаривают до сухого остатка, остаток суспендируют в этилацетате и отфильтровывают, Получают 0,26 г (70,2%) Н - 17 -ОН ЗНС 1, Р 4 0С т у п е н ь 4. 1 - 1 уз(ВОС) - Лгд - Агав Рго - Ча 1 - 1 лз (ВОС) - Ча 1 - Туг(1 гВц) - Рго- - ОН 2 НС 1 (1. - 16 - 24 - ОН 2 НС 1).0.65 г (0,49 ммоль) Н - 17 - 24 - ОН ЗНС 1 суспендируют в 7 мл диметилформамида и ,добавляют 0,07 мл триэтиламина и 0,3 г (0,6 ммоль) 1. - 1.уз (ВОС) - ОМР. Реа(кционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 час и затем упаривают до су.ого остатка. Остаток суспендируют в этилацетате, отфильтровывают и промывают небольшим количеством воды.Выход 0,6 г (76,3%) 1. - 16 - 24 - ОН 2 НС 1; Р 4 О 4,.С т у и е н ь 5. 1. - 1.уз (ВОС) - 1.уз - (ВОС) - Лгд - -Лго - Рго - Ъ" а - 1.уз (ВОС) - Ъа 1 - Туг (1 гВц) - -Рго - ОН 2 НС 1 (1. - 15 - 24 - ОН . НС),0,5 г (0,3 ммоль) 1. - 16 - 24 - ОН 2 НС 1 растворяют в 20 мл метанола и тидрируют в присутствии Рс/С, По окончании реакции катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривяют до сухого остатка, Остаток обрабатывают этилацетатом, сушат в вакууме. Выход 0,42 г (97,3%) Н - 16 - 24 - ОН 2 НС 1 Я 4 0,150,33 г (0,23 ммоль) этого продукта суопендруют з 3 смл диметилформамида и смешивают с 0,14 г (0,25 ммоль) 1. - 1.уз(ВОС) -ОРДЕР. После 10-минутного перемешивания получают 1 прозрачный раствор, который перемешивают еще 3 час и затем упаривают досухсго остатка. Остаток растирают с этилаце505352 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Составитель Л. Фонина Техрсд Е, Подурушина 1 зедактор Л. Герасимова 1 о 1 ректор Е. Хмелева Заказ 1162/12 Изд. Юв 1165 Тираж 576 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр,Сапунова, 2 5тат м. Вьхол 0,36 г (85,4%) 1. - 15 - 24 - ОН2 НС; Г,4.0 ;".Ступень 6. 1. - 1.уз(ВОС) - 1.уз(ВОС) -Аг - Аго- - Рго - Ча - 1.уя (ВОС) - Ча -Тут (1 Вц) - Рго - Агд - Ст 1 у - А 1 а - 61 ц (01 гВц) -Азр (0 Вц) - 6 ц (01 гВц) - Бег(1 Вц) 01 гВц2 НС 1 (1. - 15 - 31 - 01 гВц 2 НС 1).0,18:г (0,1 смоль) 1. - 15 - 24 - ОН 2 НС 1 и0,10 г (0,1,м моль) Н - 25 - 31 - 01 гВ ц р астворяют в 1 мл диметилформамида и к растворудобавляют 0 091 т (012 ммоль) РСС -РГРОН-комплекса. Реакционную смесь перемешивают 5 час и затем разбавляют этилацетатом. Выпавший 1 ЭСС отфильтровыва 1 от ифильтрат упаривают,до сухого остатка, Остаток растирают с эфиром, Получают 0,25 г:1 и раствор в течение 1 час перемешиваютпри комнатной температуре, Затем к раствору добавляют 300 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают эфиром.Полученный трифторацетат (2,89 г) растворяют в воде и раствор фильтруют через колонну 1:1 оъ"ех 1)(8 (ацетатная форма). Послеионообмена раствор наносят на колонку, заполненную 500 мл СМ 23 и выделяют целевой продукт градиентным элюированием.Фракции, содержащие желаегмое вещество,объединяются и лиофилизируются. Выход1,64 г (70/о) хроматотрафичеаки однородного,биологически полностью активного Н - 1 -31 - ОН,Аминокислотный анализ. 1.уя 4,08 (4); Н 1 я1,0 (1); Агд 2,94 (3); Аяр 2,01 (2); Ме 1 0,78(1); Яег 2,78 (3); Сд 1 ц 3,07 (3); Рго 2,86 (3);61 у 2,97 (3); А 1 а 1,09 (1); Уа 2,96 (3); Туг2,1 (2); Р 1 е 1,09 (1),Формула изобретенияСпособ получения полипептидов, содержащих аспарагилглициновую последовательность, общей формулыЯег - Туг - Ьег - Ме 1 - 61 ц - Ня- РЬе - Агд - Тгр - 6 у - 1.уя - Рго -- Ча - 61 у - 1.уя - 1.уя - Агу - А г р -- Рго - Ча - 1.уз - Ча - Туг - Рго -- А яп - 6 у - А 1 а - Си - А зр - Ст 1 у - .- Я где Й имеет значения:а) Ьгг - ОН;б) Бег - А 1 а - 01-1;с) Бег - А 1 а - 61 ц - ОН;д) Ьег - А 1 а - Ст 1 ц - Аа - ОН;е) Бег - А 1 а - Сеи - А 1 а - Р 1 с - ОН; ф) Бег - А 1 а - 61 и - Аа - Р 11 е -- Рго -- ОН;г) Бег - Аа - 61 и - А 1 а - Р 5 е - Рго -- 1.ец - ОН;ж) Бег - А 1 а - 6 ц - А 1 а - Р 11 е - Рго --- 1.ец - Ст ц - ОН;и) Бег - А 1 а - Сзц - А 1 а - РЬе - Рго -- 1 ец - Сеи - Р 1 е - ОН;путем конденсации соответствующих,защищснных пептидов методом активированных эфиров, последующего отщепле.пя защитных групп и выделения целевого продукта в свободном виде или в виде соли, или в виде комплекса известным способом, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью;повышения выхода целевого,продукта, карбокспльную труппу М-защищенного псптида активируют путем превращения ее в пентафторфениловый эфир обработкой пентафторфснолом в присутствии г 4,Х-лиц 11 клсгексил 1 карбодиимнда при 0 - 20 С и полученный активированный эфир копдеп ируют с С-защищенным пептидом при эквимолекулярном соотношеш 1 п реагирующих веществ,2. Способ по п. 1, отлич ающийся тем, "то к реакционной смеси, содержащей соответствующие М- и С-защпщеннье пептилы, добавляют раздельно пентафторфенол п дициклогексилкарбодиимид.3. Способ по п. 1, отлич ающийся тем, что к реакционной смеси, содержащей соответствующие Х- и С-защищенные пептилы, добавляют комплекс, состоящий из пентафторфенола и Х,К-дициклогексилакарболипмила.4. Способ по пп. 1 - 3, отличающийся тем, что остаток аспарагпна в гропессе всего синтеза находится в свободной карбоксамилной форме.5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что конденсацию К-защищенного пептпда, содержащего на С.конце остаток аспарагина с С-защищенньгм пептиом, содержащем на М-конце остаток глпцина, проводят прн температуре 0 - 4 С.6, Способ по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что пептиды, которые солержат аспарагин со свободной карбочссильной группой, ацилпруют с помощью выдесленнсго пентафторфенилового эфира трипептпла 1 - Агог (УОз) -- Агд (КО,) - Рго - ОН.