Способ получения аденозинтрифосфата

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК ПАТЕНТУ Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(71) Химический факультет МВ имМ.ВЛомоносова(73) Райнина Евгения Исаковна(57) Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получение АТФ биофосфорилированием аденозина с помощью клеток ЯассЬагопусеэ сегечвае, предварительно высушенных при 25 - 37 С. Способ позволяет при сохранении высокого выхода АТФ устранить токсичность производства, улучшить условия труда, использовать в дальнейшем отработавшую биомассу дрожжей, например, в качестве кормовых добавок 2 табл. М СР СР М СР 4 ьИзобретение относится к биотехнологии. а точнее к способу получения аденоэинтрифосфата (АТФ) с помощью клеток дрожжей рода ЯассЬагогпусез, Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине, где аденозинтрифосфат применяется в качестве лекарственного препарата.а также для получения реактивов для научнщущсследований,Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения АТФ из аденозина с помощью пивных дрожжей в реакционной среде, содержа.цей глюкозу, неорганический фосфат, сог.ь магния, толуол,Недостатком данного способа является использование в составе реакционной среды в качестве агента, повышающего клеточную проницаемость, толуола. Присутствие высокотоксичного толуола не только ухудшает условия труда при производстве АТФ, но и значительно усложняет выделение конечного продукта, так как известно, что удаление органического растворителя, тем более токсичного. из микробной реакционной смеси представляет собой серьезную проблему. Кроме того, в присутствии толуола возникает проблема обезвреживания и утилизации микробной биомассы, тогда как не содержащую толуола дрожжевую биомассу можно использовать в качестве кормовых добавок.Целью изобретения является повышение безопасности производства при сохранении высокой эффективности биофосфорилирования, защита окружающей среды.Цель достигается тем, что в способе получения АТФ биотрансформацией аденозина клетками дрожжей ЯассЬаговусез сегечзае в среде, содержащей 0,55-0,85 М неорганического фосфата при рН 7,0-7,5 в присутствии углевода и соли магния, повышение клеточной проницаемости достигается путем предварительного высушивания клеток. Известно влияние высушивания на проницаемость клеточных стенок, обусловленное изменениями в их структуре, Однако воздушно-термическое воздействие на клетки, имеющее место при высушивании, приводит к значительному снижению активности большинства ферментов. В данном случае активность ферментов, осуществляющих биофосфорилирование, не отличается от таковой в нативных клетках, и обеспечивает волную конверсию аденозина в АТФ,Способ осуществляют следующим образом, выращенную в известных условиях биомассу дрожжей ЯассЬагогпусез сегечзае сушат в потоке горячего воздуха(конвективным способом) или в термостатепри 25-37 С. Использование температурысушки клеток ниже и выше укаэанного ин 5 тервала нецелесообразно, так как приводитк значительному снижению выхода целевого продукта, Экспериментально показано,что сушить клетки можно практически любым известным способом (в термостате,10 конвективно, лиофильно), Оптимальным вданном случае является высушивание клеток дрожжей в потоке горячего воздуха при37 С в течение 40 мин, Высушенную биомассу переносят в реакционную среду, со 15 держащую аденозин, фосфат, глюкозу исоль магния, В результате удается обеспечить полную, 100-ную конверсию аденозинав АТФ,П р и м е р 1, Культивирование20 ЯассЬагогпусез сегечзае проводили на среде следующего состава (г/л дистиллированной воды): глюкоза 2,5; дрожжевой экстракт2,0; КН 2 Р 04 1,0; йаС 1,0; М 9504 Н 20 0,5;(ИН 4)2504 0,5; рН 6,5, в качалочных колбах25 объемом 750 мл (объем среды 200 мл) при30 С и скорости вращения качалки 180об/мин. Выращенную в течение 20 ч культуру фильтровали на фильтрах "5 прог" г,85мм и полученную биомассу сушили при 37 С30 конвективным способом в течение 40 мин.Сухие клетки переносили в реакционнуюсреду следующего состава: 0,6 М К-фосфатный буфер рН 7,2; аденозин 9,3 мМ; глюкоза0,55 М; М 9504 7 Н 20 20 мМ. Биотрансфор 35 мацию проводили в колбах объемом 100 мл(объем среды 25 мл) при 30 С и скоростивращения качалки 200 об/мин. При этом из2,5 г/л аденозина было получено 5,14 г/лАТФ (степень конверсии 98,6 О,).40 П р и м е р 2. Условия культивированиядрожжей и проведения биофосфорилирования такие же, как в примере 1 но варьировали температуру и продолжительностьконвективного высушивания. Результаты45 приведены в табл. 1.П р и м е р 3. Условия культивированиядрожжей и проведения биотрансформациитакие же, как в примере 1, но высушиваниебиомассы проводили в термостате, варьиро 50 вали температуру и продолжительность высушивания. Результаты приведены в табл, 2.Таким образом, отличительным признаком изобретения является предварительноевысушивание используемой для биофосфо 55 рилирования биомассы дрожжей с цельюэффективного повышения клеточной проницаемости, В сравнении с прототипом заявляемый способ позволяет получать АТФ иэаденоэина беэ добавления в среду реакциитоксичных соединений, благодаря чему уст(56) Авторское свидетельство СССР5 М 722920, кл, С 07 Н 19/20, 1978. Таблица 1 Таблица хранении высокой эффект биофосфорилирования, использую дрожжей Яасспаговусез сегечза варительно высушенные при 25- процесс проводят при рН 7,0 - 7,5 жании неорганического фосфата 0.55 - 0,85 моль. Составитель О, СкородумоваТехред М.Моргентал Корректор О. Кравцов едак Тираж НПО "Поиск" 3035. Москва, Ж, Зака Подписнатентаская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 раняется необходимость удаления органического растворителя из реакционной смеси; улучшаются условия труда при производстве АТФ; возникает возможность использовать отработавшую микробную биФормула изобретения СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТА биофосфорилированием аденозина клетками дрожжей в среде, содержащей неорганический фосфат, в присутствии углеводов и соли магния, отличающийся тем, что, с целью повышения безопасности производства и защиты окружающей среды при соивности клетки