Способ получения биоавтограмм

(19) КС митет Российской Федерации патентам и товарным знакам ОПИ Е ИЗОБРЕТЕН-ЩЯЦ,";г "Я ЙОТЕ н / К ПАТЕНТУ тину (бумагу) после разделения на мого раствора, содержащего антиб ют слоем стерильной питательной вносят инокулюм тест - объекта в вид тущего на твердой питательной ср полагая их вдоль боковых сторон ческой пластины. Изобретение по зовать в качестве тест-объектов альные грибы, в том числе не приме из-за сложности равномерного вне ма. 1 з.п.ф-лы, 2 ип, 1 табл. едовательскии инстищиты растенийо ИА.; Харбур М.В.ащиты растений АН БИОАВТОГРАММобиология, медицина.атографическую плас(21) 4311937/13(73) Институт биологическойРеспублики Молдова(57) Использование микрСущность изобретения: хром 51) 5 С 12 1 04 ней исследуеистик локрывдсреды, а затеме полосок раседе газона рас- хроматографизволяет испольлюбые мицелинявшиеся ранеесения инокулю 2001105Изобретение относится к определению биологически активных веществ в микробиологии, медицине, химии, а именно к биоавтографическому обнаружению антибиотиков в различных растворах.Известен способ обнаружения антибиотиков биоавтографическим методом, при котором исследуемый раствор наносят на хроматографическую пластину (бумагу), элюируют и высушивают. На подготовленную таким образом пластину(бумагу) наносят слой питательной среды, предварительно инокулированной спорами тест-культуры. Затем пластину помещают в условия, благоприятные для роста тест- культуры. В течение определенного времени (от нескольких часов до нескольких суток в зависимости от температуры и особенностей роста микроорганизма) споры прорастают по всей поверхности пластины. В тех местах, где располагаются антибиотики, культура тест-обьекта не растет или рост ее заметно угнетен. На хроматограммах таким образом проявляются "пятна" антибиотиков,Однако такой способ непригоден для использования в качестве тест-объектов ряда широко распространенных в природе мицелиальных грибов, таких как Ясегориа, КЬгос 1 опа и др. У этих патогенов получение спор требует особых трудоемких, долговременных и плохо воспроизводимых приемов. Например, сумкоспоры Бсегориа зсегосогогп можно получить после длительного (1 - 2 мес) промораживания склероциев с последующим помещением их во влажный субстрат, при этом в течение 30-38 сут возможно образование апотециев с сумками и сумкоспорами. Этот метод получения спор неприемлем для использования в биавтографии иэ-за длительности и плохой воспроизводимости, Такие микроорганизмы не использовались в качестве тест-объектов, Эти широко распространенные в природе патогены наносят огромный ущерб сельскохозяйственным и декоративным растениям. В настоящее время ведется широкий поиск биологических методов борьбы с этими патогенами, Поэтому воэможность их использования в биоавтографии позволит значительно расширить спектр тест-объектов, эффективно и целенаправленно проводить поиск антибиотиков и их продуцентов.Целью изобретения является расширение круга применяемых в биоавтографии тест-объектов путем возможности использования любых мицелиальных грибов, растущих на твердых питательных средах,Способ поясняется фиг. 1 и 2,Цель достигается тем, что на подготовленную хроматографическую пластину 1 (бумагу) сначала наносят слой твердой питательной среды 2 толщиной 2 - 3 мм, за тем сверху вдоль ее боковых сторон накладывают полоски твердой питательной среды с растущим на ней газоном культуры тест-объекта 3 шириной 3 - 4 мм, толщиной 2 - 3 мм и длиной, равной длине пластины 10 (фиг. 1). Пластину помещают в благоприятные для роста культуры условия, Тест-объект начинает распространяться по пластине быстро и равномерно с двух сторон, постепенно заполняя всю поверхность, При нали чии антибиотиков образуются "пятна" -зоны подавления роста тест-объекта(фиг. 2).Заявляемый способ отличается от известного тем, что инокулюм тест-объекта вносится на покрытую стерильной питательной 20 средой пластину в виде растущего мицелия,Таким образом, сложная и длительная процедура получения спор для мицелиальных грибов становится ненужной. Благодаря тому что, в заявляемом способе инокулюм 25 микроорганизма размещается полоскамивдоль боковых сторон пластины, тест-объект распространяется по ее поверхности равномерно.На пластину "силуфол" размером 35 х 30 110 мм наносят экстракт гриба ТгстобегеаЬаггапов, обладающий антибиотической активностью, Пластину элюируют в системе гексан-этилацетат-этанол 10;1:3. После высушивания ее покрывают слоем агариэован ной питательной среды толщиной 2 - 3 мм.Вдоль боковых сторон сверху накладывают полоски такой же питательной среды с растущим на ней газоном Ясегосиа зсеготогит, Толщина полосок 2-3 мм, ши рина 3-4 мм, длина 110 мм, Подготовленнуютаким образом пластину в стерильном сосуде помещают в термостат ( = 23 + 1 С), В течение 2 сут Ясего 1 иа зсегорагой равномерно покрывает всю поверхность пласти ны за исключением эон расположенияантибиотиков, имеющих йг 0,07 и 0,70Использование предлагаемого способаполучения биоавтограмм обеспечивает по сравнению с существующим способом следующие преимущества, использование в качестве тест-объектов любых мицелиальных грибов, растущих на твердых питательных средах, в том числе не применявшихся ранее; сокращение числа операций, а следова тельно, и времени на получениебиоавтограмм за счет исключения стадии получения спорового материала (см, таблицу)(56) Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1986, 448 с,2001105 Блинов Н,О, и Хохлов А.С. Бумажная хроматография антибиотиков. М.: Наука, 1970, 364 с,Сравнительная оценка способов получения биоавтограмм по прототипу и предлагаемому способу на примере тест-обьекта Я,эсего 1 огогп.П е лагаемый способ П ототип 3-4 сут Получение мицелия,3 - 4 сутне надоне надо Получение мицелия,Образование склероциев,.,Промораживание склероциев., 3-4 сут30 сут средой и наложение сверху полосок расту- Ъ щего мицелия .0,5 сут Проявление биовтограммы .,2 сут Итого: 7 опе аций, 70 с тПроявление биоавтограммы .2 сут 4 опе ации,7 с т Помещение склероциев во влажный субстрат и проращивание до обрахования апотециев с сумкоспорами .30 - 38 сут Подготовка хроматографической пластины: нанесение экстракта, элюирование, высушивание ,0,5 сутВнесение сумкоспор в питательную среду ипокрытие ею пластины 0,5 сут Формула изобретения 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОАВТОГРАММ, вклЮ- чающий покрытие хроматографической пластины после разделения на ней исследуемого раствора, содержащего антибиотик, слоем питательной среды с тест-обьектом, отличающийся тем, что, с целью расширения круга применяемых тест-обьектов, хроматографическую пластину сначала покрывают слоем стерильной питательной среды, а затем сверху,не надо Подготовка хроматографической пластины: нанесение экстракта, элюирование, высушивание,0,5 сут Покрытие пластины стерильной питательной5 вдоль боковых сторон накладывают полоски твердой питательной среды с растущим на ней газоном тест-обьекта.Ч 2. Способ по п.1, отличающийся тем,10 что полоски твердой питательной среды с растущим на ней газоном тест-объекта имеют ширину 3 - 4 мм, толщину 2 - 3 мм и длину, равную длине хромагографической 15 пластины.2001105 товскдя Корректор Н. Ревская Редактор ент Заказ 311 Тираж НПО "Поиск" Росп 5, Москва, Ж, Раув