Способ выделения вирусов при инапарантных острых и хронических формах флавивирусных инфекций

(5 ц 5 С 12 й 7/ОО ЕЙИ ЕИЗ ОПИСА ТУ П ВИВИРЧСНЫХ И бретение относитс и к вирусологии,ано для диагностиГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(71) Научно-исследовательский институтэпидемиологии и микробиологии СО АМН СССР (72) Г,Н.Леонова, С.П,Кругляк, Н,Б,Любимова, О,С,Майстровская и С.М,Мураткина (73) Г.Н. Леонова (56) Громашевский В.Л Методы изоляции арбовирусовОСборник научных трудов "Арбовирусы", М.: 1986, с. 90-93. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ВИРУСОВ ПРИ ИНАПАРАНТНЫХ ОСТРЫХ И ХРОНИ 4 ЕИэо я к медицине, в частност и может быть использов ки вирусных инфекций,Цель изобретения - повысить процент выделения вирусов из крови в ранние сроки инкубационного и лихорадочного периодов острых, а также хронических форм флавивирусных инфекций для повышения качества диагностики этих инфекций,Цель достигается путем выделения лейкоцитарной взвеси из гепаринизированной крови больного человека или животного, освобождения сконцентрированных лейкоцитов от плазмы, замораживания и оттаивания лейкоцитов для максимального выхода вируса иэ клетки,Способ заключается в следующем. Кровь больного забирают иэ вены в количестве не менее 5 мл в раствор гепарина из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, с последующим а 9).зЖоо 1 836422 АЗ СКИХ ФОРМАХ ФЛА НФЕКЦИЙ(57) Использование: медицина, в частности вирусологии. Сущность изобретения: иэ крови больного выделяют лейкоцитарную взвесь, Осадок из лейкоцитарной массы трижды замораживает в сухом льде или жидком азоте и трижды оттаивают. Затем разводят в среде 199, Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭА, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через 38 ч, Индикация и идентификация вируса производится по ЦПД в гемагглютинирующих и иммуноферментных тестах, 2 табл. отстаиванием крови в течение 45 мин при комнатной температуре. Затем тонким концом пастеровской пипетки отсасываем надэритроцитариное белое облачко, состоящее из взвеси лейкоцитов, которые затем осаждаются центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 мин, Пастеровской пипеткой удаляется супернатант, в результате чего достигается освобождение от интерферона и других ингибиторов крови. Осадок иэ лейкоцитарной массы трижды замораживается в сухом льде или жидком азоте и оттаивается. Затем разводится в среде 199. Полученной биопробой заражается суточный монослой культуры клеток СПЭВ, выращенный в пробирках, с последующим повторным пассажем через 38 ч, Индикация и идентификация вируса производится по ЦПД, в гемагглютинирующих и иммуноферментных тестах. Период обработки материала и изоляции вируса занимает 5-6 дн. Всеизолянты, полученные предлагаемым способом, подтверждены в биологическом тесте (на моделях 2-суточных белых мышей).Больные КЗ острой и прогредиентной форм и лица с "укусом" клеща обследовались классическим способом (78 проб) и предлагаемым способом (92 пробы). В группе больных КЭ острой формы изолировано классическим способом 2 штамма вируса КЭ и 1 штамм вируса Повассан, что составило 6,9 + 3,8 и предлагаемым способом - 4 штамма вируса КЭ, что составило 13,8 ф. 6,1,. Несмотря на двухкратную разницу, эти показатели статистически не различались (р0,05), В группе больных КЭ прогредиентной формы изолировано предлагаемым способом 3 штамма флавивируса от одного и того же больного, в то же.время на 3 сгустков крови этого больного выделить вирус не удалось, У лиц с "укусом" клеща вирус КЭ выделили только предлагаемым способом в пяти случаях, что составило 8,9 .ф 3,8%. Всего из 78 проб крови классическим способом выделено 3 штамма (3,8 + 2,1;4), а из 92 проб лейкоцитарной взвеси предлагаемым способом выделено 12 штаммов (13,0 + 3,5%). Разница этих показателей составила 3,4 раза и была статистически достоверной (р0,05).В табл. 1 представлена сравнительная характеристика классического и предлагаемого способов вирусологической диагностики флавивирусных инфекций.П р и м е р 1. Для подтверждения вышеуказанных результатов проведена работа по изучению вирусемии у морских свинок, прокармлиаающих сачок таежного клеща, зараженных вирусом КЗ, Заражение клещей штаммами 493 (депонент ГКВ М 900) и 155 (депонент ГКВ Ь 704) вируса КЭ проведен на стадии нимфы. Слинявших молодых; самок и самцов парно тут же подсаживали в отдельные домики, наклеенные на незараженных морских свинок. Продолжительность питания клещей составила 8-10 дн.5 10 вызывать длительную вирусемию от 2 до 18 15 сут, которая легко определяется с помощью предлагаемого способа. П р и м е р 2, Изоляция флавивирусов30 Таблиц.а 35 40 45 Кровь для исследования бралась из сердца регулярно от каждой морской свинки в разные сроки от момента присасывания (2, 4, 6, 11, 18 сутки), Изоляцию вируса проводили вышеуказанным способом.Результаты исследования представлены в табл. 2.Всего за 18 сут наблюдения получено 16 образцов крови, из которых в 13 случаях наблюдали изоляцию вируса КЭ из лейкоцитов. что составило 81,2 О. Приведенные данные свидетельствуют о том, что заведомо зараженные питающиеся клещи способны при хлорическом персистентном теченииинфекции, Больной К., 38 л, в 1988 г перенес лихорадочное состояние неясной этиологии, в серологических тестах (РТГА и ИФА) выявлены специфические антитела к флавивирусам при многократном обследовании крови больного в период от 8 до 1 г 8 мес. Классическим способом возбудитель инфекции не выявлен. Проведено обследование больного предлагаемым способом. В период клинического ухудшения состояния больного изолировано 3 штамма вируса,Обследована группа лошадей, у которых с помощью серологических методов установлена персистирующее течение флавивирусных инфекций.Формула изобретения Способ выделения вирусов при инапарантных острых и хронических формах флавивирусных инфекций, включающий отбор пробы крови и последующее накопление вируса на биологическом объекте, от л и ч а ющ и й с я тем, что из крови получают осадок лейкоцитов, который трехкратно замораживают-оттаивают и разводят в среде 199.1836422 Таблица 2 Редактор Шарош о ГКН Производственно Заказ 3008 ВНИИПИ Госуда Составитель Л,безшляхехред М.Моргентал Тираж Подписное венного комитета по изобретениям и открытия 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4(5 ельский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 1