Способ определения вида бактериальной инфекции

(л) оц 44 А 4(зц А 61 В 1 О/00 ГОСУДАРСТВЕНПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕ САНИЕ ИЗОБРЕТ СВИДЕТЕЛЬСТ К АВТОРСК Бе Челн ти-,(53) 615.375 (088.8)(56) Меньшиков Ю.Ю. Бактериолкие исследования при гнойно-влительных процессах мягких тней. - "Лабораторное дело",Иф 2,. с. 67-71. огичесоспаа 980,(21) (22) (46) . (72) А.В и Л (71) НЫИ НОМИТЕТ СССР ТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ 3520102/28-13.10.12.8223,05.85. Бюл. В 19Л.Я. Эберт, А.В. ЧукичеЗурочка, С,И. МарачевНовокрещеновбинский медицинский(54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДАБАКТЕРИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ включающийвыделение бактериальных клеток иэпатологического материала больных,о т л и ч а ю щ и й с я .тем, что,с целью повышения точности способаи сокращения времени.исследования,дополнительно из крови того ае больного выделяют гракулоцнтм и иссле- .дуют их хемотаксическую активность.но отношению к ввщеленнвве вивым бактериям и при индексе хемотаксисаменьше одной условной единицы определяют вид бактериальной инфекции.56 б 44 2 3 11Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии и иммунологии.Цель изобретения - повышение точности определения вида бактериаль-, ной инфекции и сокращение времени исследования.Способ осуществляют следующим образом.У больного забирают 10 мл венозкой крови и помещают в силикониэированные пробирки, содержащие 250 ЕД гепарика (25 ЕД/мл). Осаждение эритроцитов производят путем отстаивания крови при 37 С в течение 1 ч после добавления 1 мл 10%-ного раствора желатины, В период осаждения эритроцитов готовят агарозкый гель.Приготовленный агарозный гель раз ливают в пластмассовые лабораторные чашки Петри для однократного пользования, на дне которых находятся покровные стекла размером 24 24 мм. Объем агарозного геля на одну чашку ранен 3 мл. Для формирования лунок в агарозком геле применяется стандартный штамп, представляющий собой металлический (латунный) диск, диаметром 40 мм и высотой 15 мм, на нижней поверхности которого распо,лагаются 9 полых латунных стержней с наружным диаметром 2,4 мм. Стержни располагаются по строго перпен" дикулярно перекрещивающимся линиям, При этом один из стержней находится в точке перекрещиваниялиний, а остальные стержни попарно располагаются на этих линиях, Расстояние между стержнямн 2,4 мм, Высота стержней должка быть строго одинакова и не менее 1 см. 5 1 а 15 20 25 ЗО 35 40 45 50 После приготовления чашек с агарозным гелем последние помещают в эксикатор с углекнслым газом. Зкси,катор с чашечками выдерживают до появления оранжевой окраски агарозного геля. По окончании данной манипуляции чашки с агарозкым гелем считаются готовыми для определения хемотаксиса гранулоцитов под агарозой.Для получения взвеси лейкоцитов образовавшееся после осаждения эрит- роцитов кольцо сыворотки осторожно удаляют из пробирки и наслаивают ка 2 мл градиента плотности фнколл-верографик И = 1,077), После центрифугирования при 1500 об/мин (400 8) в течение 20 мин образовавшиеся слой плазмы, слой фиколл-веро- графина и между ними слой мононуклеаров (лимфоциты и моноциты) удаляют. К оставшемуся на дне пробирки осадку, содержащему гранулоциты и примесь эритроцитов, добавляют 8 мл 0,83%-кого раствора хлористого аммония с целью разрушения эритроцитов. После ресуспекдирования полученную взвесь гранулоцитов инкубируют в течение 10 мик при О С. Далее гракулоциты отделяют от раствора хлорйстого аммония и элементов разрушенных эритроцитов путем трехкрат-. ного промывания в растворе Хенкса и центрифугированЪя при 1500 об/мин в течение 10 мик, Отмытые грануло- . циты разводят в среде 199 до концентрации 10 клеток/мл.В качестве хемоатрактантов используют взвесь чистых живых культур бактерий концентрации 10 бактерий/мл. Взвеси бактерий получаются путей смыва стерильной средой 199 суточных культур. Концентрация .бактерий определяется по стандарту мутности.После приготовления всех исходных ингредиентов (взвеси гранулоцитов, чашек с агароэным гелем, бактериальных хемоатрактантов) и центральную лунку вносят пастеровской пипеткой 0,02 мл среды 199. В средние лунки помещается суспензия гранулоцитов, а в крайние - различные бактериальные хемоатрактанты. При этом ка одной чашке с агароэным гелем становится возможным изучение хемотаксиса одновременно к четырем предполагаемьщ видам возбудителей инфекции. Завершив описанный этап, эксикатор с чашечками и добавленным в него углекислым газом помещают в термостат на 3 ч при 37 С. По окончании этого срока для фиксации. клеток к стеклу чашки заливают 47%-ным раствором формалина илк метиловым спиртом. После 30-минутной фиксации слой агароэного геля удаляют и стекло промывают в проточной воде. Учет результатов осуществляютпод микроскопом (увеличение 5 б) епомощью окулярного микрометра. Дляэтого измеряют две эоны миграциигранулоцитов: в сторону бактериаль15 бб 44 4 10 15 20 25 30 35 45 50 3ного хемоатрактанта (А) и в сторонусреды 199 (В). Индекс хемотаксисаА (ИХ) вычисляется по формуле ИХ = - .ВИнтерпретация результата исследования осуществляется следующим образом, если индекс хемотаксиса гранулоцитов к изучаемому бактериальному хемоатрактанту меньше 1 усл.ед. то это указывает на наличие соответственной бактериальной инфекции у обследуемого больного.Общая продолжительность исследования 5-б ч.П р и м е р. Больная Т.Н 8 лет, госпитализирована в клинику детской хирургии через 7 сут с момента заболевания с диагнозом: острый гематогенный остеомиелит правой подвздошной кости, септикопиемическая форма, реактивный артрит правого тазобедренного сустава, двусторонняя септическая пневмония, токсический миохардит, При поступлении у больной определен индекс хемотаксиса гранулоцитов к пяти различным бактериальным хемоатрактантам (золотистый стафилококк, синегнойная палочка, кишечная папочка, протей, стрептококк), При этом обнаружено снижение индекса хемотаксиса гранулоцитов к золотистому стафилококку до 0,3 усл.ед., в то время как к другим хемоатрактантам индекс был больше 1 усл.ед. Заключение: возбудителем гнойно-воспалительного заболевания у ребенка является золотистый стафилококк.Одновременно с исследованием хемотаксиса гракулоцитов проводилось бактериологическое исследование крови и экссудата из гнойного очага, В результате бактериологического исследования на 4-е сутки из гнойного очага выделен золотистый стафилококк. Аналогичный результат .получен на 10-е сутки при исследовании гемокультуры, Таким образом, результаты исследования, полученные с помощью предпагаемого способа, были проконтролированы и подтверждены известными бактериологическими способами.Для диагностики вида бактериальной инфекции способ был применен у 12 больных с острьачи гнойными хирургическими заболеваниями (острьй г матогенный остеомиелит, острая гнойная деструктивная пневмония, осложненная абсцессами легкого, пиопневмотораксом, пиотораксом, флег мона мягких тканей) . При исследовании индекса хемотаксиса граиулоцитов больных к различным бактериальным хемоатрактантам (золотистый стафилококк, кишечная палочка, сине- гнойная палочка, протей, стрептококк) было обнаружено, что у девяти больных индекс хемотаксиса к золотистому стафилококку бып меньше 1 усл.ед., у двух больных - к сине- гнойной палочке, а у одного больного наблюдалось одновременное сникение индекса хемотаксиса к кишечкой палочке и стрептококку. При бактериологическом контроле у семи больных .был выделен стафилококк, у двух - синегнойная палочка,у одного больного - кишечная палочка и стрептопокк. У двух больных при посеве гноя роста микрофлоры не было получено. Однако изучение хемотаксиса. гранулоцитов у этих больных к стафилококку выявило значительное снижение индекса, соответственно 0,33 и 0,4 б усл.ед. В то же время, индекс хемотакснса к кишечной па" лочке, синегкойной палочке, протею и стрептококку у них превышап 1 усл.ед, Учитывая эти данные, можно говорить о наличии стафилококковой инфекции у этих больных, несмотря на отрицательный результат бактериологического исследования.Таким образом, способ позволяет сократить сроки определения вида бактериальной инфекции в 4-40 раз, что дает воэможность своевременно назначить больным этиологически обоснованную иммунофаго- и химиотерапию, повысить точность исследования с 83 до 1 ООЖ, а также.более точно диагностировать возможные ассоциации возбудителей у больного (наличие одновременно двух и более возбудителей инфекции у больного), уменьшить весь объем диагностических мероприятий путем проведения целенаправленных бактериологический исследований.