Способ выявления чумного микроба

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 9) (1) И 1/О 0 1 0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ вательский и Дальнего МНОГО А. 1(72) Г,П, Апарин и Т.И. Вершинина56) Руководство по профилактике чумы. /Поред. Николаева Н.И. - .Саратов, 1972, 200 с.Труды института "Микроб". - Саратов1960, вып.4, с, 358-368.(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЧУМИКРОБА Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в частности для ускоренной идентификации возбудителя чумы в экспедиционных и стационарных условиях,Известны способы изучения прямого действия бактериофага на плотных и в жидких.питательных средах.Наиболее близким па технической сущности является ускоренный способ, включающий использование приема смешивания исследуемого материала с чумным бактериофагом, контакт чумного бактериофага с культурой микроба на пластинке питательного агара при 28 С с последующей микроскопией, Появление негативных колоний бактериофага свидетельствует о наличии в исследуемом материале возбудителя чумы.Однако известный способ имеет следующие недостатки: результат учитывается, начиная с 5 да 12 ч; действие чумного бактериофага недостаточно специфично, он может лизировать и штаммы возбудителей псевдотуберкулеза, дизентерии, сельмонеллеза, а также кишечную палочку,(57) Использование: медицинская микробиология, Сущность изобретения; выявление чумного микроба проводят путем контакта чумного бактериофага с возбудителем чумы, смешивая каплю из суспензии исследуемой агаровой культуры с цельным диагностическим фагом перед нанесением на агаровую пластинку, После совместнаго инкубирования на агаровой пластинке при 28 С в течение 4 ч делают мазок-отпечаток, окрашивают его и чумной микроб выявляют по. наличию в марках клеточного детрита. 1 табл. Цель изобретения является ускорение и повышение специфичности способа,Указанная цель достигается тем, что согласна способу, включающему контакт чумного бактериофага с возбудителем чумы, каплю смеси из суспензии гаровой культуры с цельным диагностическим фагом наносят на пластинку питательного агара, посев падращивают при 28 С в течение 4 ч, делают мазок-отпечаток с последующей микроскопией.Существенность отличий предлагаемого способа заключается в том, что осуществлен новый подход к учету феномена фаголиэабельности. Исследователь получает возможность наблюдать действие фага на микробную клетку непосредственно, а не судить а ней косвенно по отсутствию роста на питательном агаре,Способ осуществляют следующим образом,Готовят суспензию изучаемого штамма иэ односуточной агаровой культуры концентрацией 10 м,к./мл в абьеме 3 мл. добавляют 0,1 мл коммерческого диагностическогочумного бактериофага и хорошо перемешивают. Каплю полученной смеси наносят в центр пластинки питательного агара, подсушивают, инкубируют посев при 28 С в течение 4 ч, Делают мазок-отпечаток, фиксируют, окрашивают одномоментно фуксином, кристаллвиолетом или метиленовой синью и просматривают под микроскопом. С контролем проделывают те же манипуляции эа исключением добавления бактериофага,При действии фага в мазках регистрируют клеточный детрит и единичные клетки фагоустойчивых мутантов чумного микроба, увеличенные в размерах вследствие феномена физиологического гигантизма, что свидетельствует об их жизнеспособности. При отсутствии лизиса в опыте и контроле наблюдают одинаковую картину - сотни клеток в поле зрения.П р и м е р 1, К 3 мл одномиллиардовой суспензии чумного вакцинного штамма ЕВ добавляют 0,1 мл чумного диагностического фага, каплю смеси наносят на поверхность агара и после четырехчасовой инкубации при 28 оС делают мазок-отпечаток с места посева. Контроль - то же самое. но без контакта с фагом, При просмотре окрашейных мазков-отпечатков с опытной взвеси обнаруживают клеточный детрит, от 1 до 5 крупных клеток не в каждом из 20 просмотренных полей зрения; в контрольной взвеси - в каждом поле зрения сотни крупных клеток, что свидетельствует о действии фага на изучаемую культуру.П р и м е р 2. Способ осуществлен с штаммом У, рзецбоЫЬегсоозфз 21/250, который лизируется чумным диагностическим бактериофагом в прототипном варианте, В результате в опытном мазке-отпечатке, как и в контрольном, регистрируют множество увеличенных в размерах микробных клеток до сотен в поле зрения, что указывает на отсутствие действия фага на культуру псевдотуберкулезного микроба.Всего испытано 129 штаммов чумного микроба, выделенных от млекопитающих и эктопаразитов в различных очагах Советского Союза и МНР. Штаммы относились к различныМ подвидам, что свидетельствовало о разнообразии их биологических свойств, включая плаэмидный состав, Испытывались также субкультуры отдельеных штаммов, отличающиеся от исходных по кальцийэависимости и пигменетсорбции, Для проверки стабильности результатов 11 штаммов исследовали по 3-6 раз. Всего45 50 55 15 20 25 ЗО 35 40 проведено 160 испытаний штаммов возб дителя чумы и его субкультур с использованием предлагаемого и иэвестнога способов Во всех случаях получали однозначные реэультатыДля подтвереждения специфичность предлагамого способа изучали 43 штамма возбудителя псевдотуберкулеза (включая 15 штаммов, которые в момент выделения лизировались чумным фагом по известномуспособу), 16 штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза, 10 - шигелл; 8- сальмонелл, 5- кишечной палочки, Результаты представлены в таблице.Как видно иэ таблицы, специфичность предлагаемого способа высока. На штаммы возбудителей кишечного иерсиниоза, аигелл, сальмонелл и кишечной палочки, чумной фаг по предлагаемому и известному способам не действовали. Преимущества предлагаемого способа выявлены для штаммов псевдотуберкулезного микроба. Если по известному способу некоторые культуры лиэировались чумным фагам, то предлагаемый способ ни в одном случае не выявил зто неспецифическое действие.Особенностью способа является возможность судить о чувствительности к бактериофагу непосредственно по микроскопической картине в мазке-отпечатке: клеточный детрит и единичные жизнеспособные клетки чумного микроба после контакта с фагом, в контроле - сотни неповрежденных микробйых клеток в поле зрения,Способ можно использовать для ускорененой идентификации чумного микроба: он позволяет ускорить определение фаголиэабельности с 5-12 до 4 ч, выявляя строго специфическое действие чумного диагностического фага исключительно на культуры чумного микроба. Формула изобретения Способ выявления чумного микроба, включающий совместное инкубирование исследуемой культуры и чумного бактериофага на агаровой пластинке с последующим учетом результатов микроскопированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности способа, перед нанесением на агаровую пластинку исследуемую культуру смешивают с чумным бактериофагом, после инкубации для микраскопирования готовят мазки-отпечатки, окрашивают их и чумной микроб выявляют по наличию в мазках клеточного детрита,1756347 дактор Н.Рогулич роизводственно-издательский комбинат "Патент", г ул.Гагарина, 10 аказ 3062 ВНИИП Составитель Г,Апаринехред М,Моргентал Корректор С,Патрушев Тираж Подписноесударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5