Способ определения тетрациклинов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 42713 А 19 й.О. 15 601 М 30/ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ К АВТОРСКО ИДЕТЕЛЬС 23чно-исследовательскийой санитарииГ, Я, С имо не н кова. нушов татья ФС-2129-8 др, Тонкослоиная хроии и клинической биоО. т,1. с,273.ЕЛЕНИЯ ТЕТРАЦИ носится к сельскому хок ветеринарии, и может при контроле качества(21) 4813956/25 (22) 12,04.90 (46) 23,06,92. Бюл.й (71) Всесоюзный на институт ветеринар (72) А,М,Смирно Н.С.Мороз и А,Т,Жу (53) 543.544 (088,8) (56) ФармокопейнаШаршунова М. матография в форм химии. - М.: Мир, 1 (54) СПОСОБ ОП Р Е ЛИНОВ(57) Изобретение от зяйству, в частности быть использовано Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии. и может быть использовано при контроле качества меда,Известен способ определения тетрациклинов (в частности. в сыворотке крови) путем добавления к пробе тетрациклина растворителя, нанесения полученной пробы на пластину для тонкослойной хроматографии, пропитанную предварительно 0,1 М раствором трилона Б, с последующей разгонкой в смеси этилацетата с ацетоном и водой,Однако данный способ не может быть использован для идентификации и определения в меде остаточных количеств тетрациклинов с высокой точностью.Целью изобретения является повышение точности способа при определении тетрациклина в меде. меда. Тетрациклины определяют путем добавления к пробе растворителя, нанесения полученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительно пропитанные 0,1 М раствором трилона Б, с последующей разгонкой пробы в смеси эталацетата с ацетоном. В качестве растворителя применяют смесь 0,005 - 0,015 н,соляной кислоты с ацетоном при объемном соотношении пробы соляной кислоты и ацетона 4,0 4-4,5:1;3,5-4,0. а раствор трилона Б используют с рН 4,5 - 4,8. Способ позволяет идентифицировать и определять остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, метациклин и доксициклин) на уровне 0,0005% или 0.005 мг на 1 г меда. Для достиженгя поставленнои цели согласно способу определения тетрацикли ов путем добавления к пробе меда раствори;е- ф ля. нанесения полученной пробы на пластину для тонкослойной хроматографии.предварительно 0,1 М раствором трилона Е, рН 4,5 - 4.8, с последующей разгонкой в смеси зтилацетата с ацетоном и водой. в качестве растворителя используют с 1 ес ь 0,005 - 0,015 н,раствора соляной кислоты и ацетона в обьемном соотношении пробы, соляной кислоты и гщетона 4,0 -. 4,5:1:3.5 - 4.0.Способ осуществляют следующим образом.Подготовка к анализу.Для приготовления 0,1 М растьора трилона Б 3,76 г трилона Б вносят в мерную колбу вместимосгыо 100 мл, растворяют в небольшом количе:тве воды. объем растеования (ТУ 15/16 ЭССР-88) многоразового 40 50 55 ра в колбе доводят до метки водой, перемешивают, рН полученного раствора должен быть 4,5 - 4,8 (проверяют потенциометрически), при необходимости рН раствора доводят до нужного значения 10 оо-ным раствором едкого натра.Приготовление стандартных растворов тетрациклинов,По 50 мг каждого антибиотика (тетрациклин,окситетрациклин,метациклин и доксициклин) вносят в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл 0,01 н, соляной кислоты, встряхивают до полного растворения, затем объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном. Вносят 5 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора в колбе до метки ацетоном (раствор 1),Приготовление стандартного раствора доксициклина для определения всех тетрациклинов.Вносят 50 мг доксициклина гидрохлорида в мерную колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл 0,01 н.раствора соляной кислоты, встряхивают до полного растворения, объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном, перемешивают. Вносят 5 мл этого раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора в колбе доводят до метки ацетоном (раствор 2),Подготовка пробы меда для анализа.К 4,0 - 4,5 мл (4,5 - 5,5 г) меда в колбе с притертой пробкой прибавляют 1 мл 0,005 - 0,015 н.соляной кислоты, тщательно перемешивают, растирают, прибавляк 5 т 3,5 - 4,0 мл ацетона, перемешивают (раствор 3).Подготовка и регенерация хроматографических пластин,Готовые пластины для хроматографироиспользования размером бх 10 см помещают на 30 мин в 0,1 М раствор трилона Б (рН 4,5 - 4,8) для пропитывания, Пластины вынимают, сушат на воздухе в течение 2 - 3 ч и помещают в сушильный шкаф на 1 ч при 105 - 110 С для активирования. Охлажденная пластина готова для анализа,После проведения хроматографического анализа пластины регенерируют, помещая их в раствор хромовой смеси (осторожно) на 5-10 мин, пинцетом вынимают и переносят в сосуд для промывания в проточной воде в течение 30 мин, Окончательно каждую пластину промывают дистиллированной водой (100 мл), высушивают на воздухе, затем пропитывают раствором трилона Б и активируют, как указано выше,5 10 15 20 25 ЗО 35 Приготовление подвижной фазы (система растворителей) для хроматографирования.В мерном цилиндре с притертой пробкой вместимостью 50 - 100 мл смешивают 20 мл этилацетата, 19 мл ацетона и 3 мл воды, подвижную фазу выливают в хроматографическую камеру с притертой крышкой,Выполнение анализа.На линию старта стеклянной пластины наносят следующие пробы в точки на расстоянии 1 см одна от другой и на 1,5 см от края нижнего пластины;5 мкл раствора 1 (0,1 мкг каждого антибиотика);5 мкг раствора (0,1 мкг дексициклина);5, 10 и 20 мкл раствора 3 (проба меда),Пластину с нанесенными пробами высушивают на воздухе в течение 1 - 2 мин, помещают в камеру со смесью растворителей этилацетат;ацетон:вода (20;19:3) и хроматографируют восходящим способом,Когда фронт растворителей поднимется на 7 - 8 см от линии старта, пластину вынимают иэ камеры, сушат на воздухе 10 мин, потом 5 мин в сушильном шкафу (при 100 С), После охлаждения пластину помещают на 3 - 5 мин в камеру с парами аммиака и затем просматривают в свете лучей УФ-лампы при длине волны 366 нм, На хроматограмме должны быть видны 4 эоны антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 1:метациклин с сэпо доксицсик. =0,47+ 0,05; тетрациклин с Вяпо доксицик.= =0,76 + 0,05; доксициклин с Вэпо доксицик. = =1,0 + 0,05 и окситетрациклин с сэпо доксицик = 1,18 + 0,05, Сравнивают интенсивность свечения зон пятен веществ, полученных при хроматографировании раствора 3 (проба меда), нанесенного в разных количествах (от 5 до 20 мкл) с помощью микрошприца или пипетки с интенсивностью свечения зон пятен веществ, полученных при хроматографировании раствора 1. Интенсивность зон свечения антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 3, должна быть не более интенсивности эон свечения антибиотиков, полученных при хроматографировании раствора 1.Обнаруженное количество каждого антибиотика в пробе меда по предлагаемому способу составляет 0,00057 О или 0,005 мг на 1 г меда,П р и м е р 1. Помещают 4 О мл меда (образец 1) в колбу с притертой пробкой, прибавляют 1 мл 0,005 н,солян . кислоты, перемешивают, растирают, добавляют1742713 Формула изобретения 45 50 Составитель В, ТолстыхРедактор В. Петраш Техред М.Моргентал Корректор Т, Палий Заказ 2281 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 3,5 мл ацетона. Пластины для хроматографирования подготавливают так же, как указано выше, но рН 0,1 М раствора трилона Бравен 4,5; сушат на воздухе 2 ч и активируютпри 105 С, На пластины наносят следующие пробы в точки на расстоянии 1 см однаот другой,5 мкл раствора 1 (приготовление стандартного раствора тетрациклинов описановыше);5 мкл раствора 2 (приготовление стандарта доксициклина для определения тетрациклина описано выше);5, 10 и 20 мкл раствора 3 (проба меда),При просматривании пластин послехроматографирования в свете УФ-лампыобнаружен окситетрациклин, интенсивность зоны свечения которого соответствует 0,01 мг антибиотика на 1 гмеда.В примере применяли 3 пробы меда,При использовании для определения остаточных количеств тетрациклинов известнымспособом не было обнаружено тетрациклинов ни в одной из проб.П р и м е р 2, Определение осуществляют одновременно на 3 пробах меда (образец 2),К 4,5 мл меда в колбе с притертойпробкой прибавляют 1 мл 0,015 н,солянойкислоты, тщательно перемешивают, растирают, прибавляют 4,0 мл ацетона.На линию старта подготовленной какуказано выше хроматографической пластины, но с пропитыванием 0,1 М растворомтрилона Б при рН 4,0 и сушке на воздухе3 ч при активировании в шкафу со 110 С,нанося-. следующие пробы в точки:5 мкл раствора 1 (стандарт - смесь тетрациклинов);5 мкл раствора 2 (стандарт доксициклина);5, 10 и 20 мкл раствора меда.При просматривании пластины под УФлампой после процесса хроматографирования не обнаружено зон свечения тетрацикли нов.П р и м е р 3. Берут 3 пробы меда (образец 3) по 4,25 мл, к каждой пробе прибавля 5 ют 1 мл 0,01 н,солянойкислоты и 3,75 млацетона, далеевсе операции проводят как впримерах 1 и 2, Пластины пропитывают темже раствором трилона Б, но рН 4,65, сушатна воздухе 2,5 ч, активируют при 107 С, На10 пластину наносят пробы в той же последовательности и количествах,.как в примерах1 и 2,После проведения процесса хроматографирования и просматривания пластины в15 свете УФ-лампы обнаружена зона свеченияокситетрациклина, интенсивность которойсоответствует 0,005 мг антибиотика на 1 гмеда,Способ позволяет идентифицировать и20 определить остаточные количества антибиотиков из группы тетрациклина (тетрациклин, окситетрациклин, метациклин идоксициклин) на уровне 0,0005или0,005 мг на 1 г меда.125 Способ определения тетрациклинов путем добавления к пробе, содержащейтетра 30 циклин, растворителя, нанесенияполученной пробы на пластины для тонкослойной хроматографии, предварительнопропитанных 0,1 М раствором трилона Б споследующей разгонкой пробы в смеси зти 35 лацетата с ацетоном, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения точности спо.саба при определении тетрациклина в меде,в качестве растворителя используют смесь0,005 - 0,015 н,соляной кислоты с ацетоном,40 взятых в объемном соотношении проба:соляная кислота:ацетон, равном 4,0 -4,5:1:3,5 - 4,0, а раствор трилона Б используют с рН 4,5 - 4,8,