Способ получения пепсина

)5 С 12 й 9/50 РЕТЕНИЯ К АВТОРСКО ВИДЕТЕЛ ЬСТВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ(71) Научно-исследовательская лабораториябиологически активных веществ гидробионтов(56) Авторское свидетельство СССРМ 1652342, кл, С 12 й 9/50, 29.12.1989.(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПСИНА(57) Изобретение Относится к области биотехнологии, а именно к способу комплексного получения препарата пепсина изв нутрен н остей рыб. Цель - повышен иеудельной активности целевого продукта иупрощение способа. Для осуществленияспособа всю массу внутренних органов рыб Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу комплексного получения препарата пепсина из внутренних органов рыб, которые могут найти применение в научно-исследовательской деятельности, медицине, пищевой и кожевенной п ромы шленностях.Пепсин (КФ 3.4.23.1) - протеаза, эффективно гидролизующая пептидныесвязи белков при кислых значениях рН. Наиболее хорошо изученными являются пепсины млекопитающих. Хотя активность пепсина ранее обнаружена и у рыб, фермент из данного источника изучен недостаточно.Известны способы получения пепсина иэ таких рыб как треска, сельдь, анчоус, мойва, кета. В большинстве случаев в качестве сырьевого источника были использованы гомогенизируют в растворе с кислым значением рН и центрифугируют, К супернатанту последовательно приливают третбутиловый спирт в соотношении 1-(0,3-1), а затем сульфат аммония, осаждая пепсин в интервале концентраций между 12-170 и 35-450. Сформировавшийся осадок, содержащий пепсин, растворяют в 5 мМ-ацетатном буфере, рН 5,0. Дпя активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2,0 и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4 - 5 с помощью раствора ацетата натрия, после чего для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500 - 3700 ед/мг белка, Выход по активности равен 55 - 600/,желудки. Выделение пепсина из этих источников включает гомогенизацию, центрифугирование, фракционирование белков сульфатом аммония, ионообменную хроматографию и гепьфильтрацию в различных сочетаниях и различной последовательности. К недостатку описанных методов очистки относят ее многостадийность, что приводит к значительным потерям фермента и невысоким значениям выхода, Кроме того, недостатком является использование в качестве сырья выбранных из общей массы внутренних органов желудков, что делает данный процесс нетехнологичным.Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения пепсина рыб. Всю массу внутренних органов гомогенизируют в растворе рН 2 - 6, инкубируют 3 - 20 ч прикомнатной температуре и центрифугируют 30 мин при 19000 д,4 С, Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 1,7 - 2,4 и инкубируют 15 - 300 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции акти вации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 19000 д 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, 10 рН 5, а впоследствии наносят на колонку сДЭАЭ-носителем, уравновешенным тем же буфером, Ферментативную активность элюируют тем же буфером, Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину 15 равна 1400 - 2800 ед/мг белка, Выход по активности равен 30-87 .Недостатками являются невысокая удельная активность пепсина, низкая технологичность процесса за счет применения 20 стадии ионообменной хроматографии.Цель изобретения - повышение удельной активности пепсина и упрощение его технологического процессаПоставленная цель достигается тем, что 25 всю массу внутренних органов гомогенизируют в растворе с кислым значением рН и центрифугируют, после чего супернатант используют для получения пепсина. К супернатанту приливают трет-бутиловый 30 спирт в соотношении- (0,3 - 1), а затем добавляют сульфат аммония, осаждая сначала балластные вещества при концентрации 12 - 17 а затем высаливая пепсин при концентрации 35 - 45 , Сформировавшийся 35 осадок, содержащий пепсин, растворяют в 5 мМ ацетатном буфере, рН 5,0. Для активации пепсиногена рН гомогената доводят до 2,0 и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции акти вации рН поднимают до 4 - 5 с помощью раствора ацетата натрия, после чего для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 45 3500 - 3700 ед/мг белка. Выход по активности равен 55-60 .В предложенном способе активность целевого препарата пепсина увеличивается до 3500 - 3700 единиц на 1 мг белка, упроща ется способ очистки за счет удаления стадии ионообменной хроматографии,Верхняя граница величины объемного отношения гомогената к трет-бутиловому спирту обусловлена тем, что при соотноше нии выше 1:1 наблюдается инактивация фермента в присутствии органического растворителя.Нижняя граница величины объемного отношения гомогената к трет-бутиловому спирту обусловлена тем, что при соотношении ниже 1:0,3 наблюдается понижение выхода очистки и не удается полностью освободиться от липидов.Верхняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении пепсина обусловлена тем, что при концентрации выше 45 наблюдается дополнительное соосаждение балластных белков, что приводит к понижению удельной активности целевого продукта,Нижняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении пепсина обусловлена тем, что при концентрации ниже 35 не удается количественно выделить пепсин,Верхняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении балластных веществ обусловлена тем, что при концентрации выше 17 наблюдается дополнительное соосаждение пепсина, что приводит к понижению выхода целевого продукта.Нижняя граница концентрации сульфата аммония при осаждении балластных веществ обусловлена тем, что при концентрации ниже 12 не удается полностью отделиться от примесных веществ.Предлагаемый способ заключается в следующем. 200 г внутренних органов рыб гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют в 40 мин при 5000 об/мин, 4 С. К 650 мл супернатанта приливают трет-бутиловый спирт (соотношение 1:0,3 - 1), а затем добавляют сульфат аммония до концентрации 12-15 , растворяя его при перемешивании, После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь вновь добавляют сульфат аммония до концентрации 35-45 , перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсиногена раствор доводят до рН 2 с помощью 2 н НС и инкубируют ЗО мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4 С. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину 3500 - 3700 ед/мг белка, Выход по активности 55-60;.П р и м е р 1. 200 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4 С. К 650 мл супернатанта приливают 200 мл трет-бути1723123 П р и м е р 3. 200 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4 С. К 650 мл супернатанта приливают 325 мл трет-бутилового спирта (соотношение 1:0,5), а затем добавляют 165,75 г сульфата аммония (кон 10 15 20 25 30 Формула изобретения Способ получения пепсина, включающий гомогенизацию внутренностей рыб, отделение ферментсодержащего раствора, очистку, активацию целевого продукта и его выделение, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта и упрощения способа, очистку и выделение ведут путем последовательного добавления к ферментному раствору трет-бутилового спирта в соотношении 1:(0,3 - 1), сульфата аммония в концентрации 12-17, затем в концентрации 35 - 45, а активацию проводят после выделения целевого продукта,40 45 50 Составитель И.СахаровТехред М,Моргентал Корректор О.Кундрик Редактор Н,Горват Заказ 1042 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 лового спирта (соотношение 1:0,3), а затем добавляют 102 г сульфата аммония (концентрация 12), растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавляют еще 195,5 г сульфата аммония (концентрация 35 ), перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0, Для активации пепсиногена рН раствора доводят до 2 с помощью 2 н НС и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натрия, Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4 С, Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3700 ед/мг белка. Выход по активности 59 .П р и м е р 2. 200 г внутренних органов трески гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин,4 С, К 650 мл супернатанта приливают 650 мл трет-бутилового спирта (соотношение 1:1), а затем добавляют 195,0 г сульфата аммония (концентрация 15 ), растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в .водноорганическую смесь добавляют еще 325,0 г сульфата аммония (концентрация 40 ), перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсиногена раствор доводят до рН 2 с помощью 2 н, НС и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 5,0 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4 С. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500 ед/мг белка. Выход по активности равен 60,центрация 17), растворяя его при перемешивании. После центрифугирования 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийся осадок отбрасывают, а в водноорганическую. смесь добавляют еще 273 г сульфата аммония (концентрация 45), перемешивая до полного растворения и центрифугируя вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок растворяют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Для активации пепсиногена рН раствора доводят до 2 с помощью 2 н. НС и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Для окончания реакции активации рН поднимают до 4,0 с помощью 4 М раствора ацетата натрия. Для отделения образовавшегося осадка раствор центрифугируют и ри 5000 об/мин 40 мин,4 С. Удельная активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3620 ед/мг белка. Выход по активности равен 55 )ь.Таким образом, предложенный способ позволяет повысить удельную активность продукта, а также упростить технологический процесс и тем самым повысить его экономичность,