Ингибитор размножения вируса иммунодефицита человека

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 804848 А 9) и м)5 А 61 К 31005 НИ Е И О ИСА К А НИЯ ВИРУСА к медицине, а изобретения - анти-ВИЧ акют пента-О-ниой кислоты в ющего свойства руса иммунодеГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОВЕДОМСТВО СССР(46) 30.03.93, Бюл. М 12 (71) Научно-производственное объединение "Вектор", Институт химии Башкирского научного центра Уральского отделенияАН СССР(72) А.Г,Покровский, О.А,Плясунова, Л.А,Цалтина, Г.А.Толстиков и Ю.И,Муринов (56) С,М.Коломиец, Н.Д.Коломиец "Современные возможности терапии СПИДа", ж,: Здравоохранение Белоруссии, 1988, (ч. 1, с. 47. Изобретение относится к области вирусологии, медицины, а именно, к разработке й поиску новых противовирусных препаратов, обладающих анти-ВИЧ активностью.Цель изобретения - расширение спектра противовирусных препаратов, обладающих Энти-ВИЧ активностью.Поставленная цель достигается применением пента-О-никотината глицирризиновой кислоты, 3-(Р-2,3,4-три-О-никотинилглюкуронопиранозил)1 -ф 2(а-3,4-ди-О- никотинил-глюкуронопиранозид глицирретовой кислоты (ниглизина) в качестве ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека,Сущность изобретения заключается в следующем.Первично инфицированные ВИЧи ВИЧклетки МТили хронически инфицированные ВИЧклетки Э В К-ИРА/3 культивируют в присутствии препарата ниглизина, конечная концентрация которого в культу- ральной среде составляет 0,5 - 1,0 мгlмл и без него (контроль) на протяжении одного пассажа - в течение 4-х суток, Об ингибиро(54) ИНГИБИТОР РАЗМНОЖ ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛО (57) Изобретение относится именно к вирусологии. Цель повышение специфической тивности. Для этого использу котинат глицирризинов качестве вещества, проявля ингибитора размножения ви фицита человека. 2 табл,ваниирепродукции ВИЧ в клетках судят по снижению активности обратной транскриптазы в культурэльной жидкости и накоплению вирусного антигена (по данным иммуноферментного анализа) на 4-ые сутки культивирования по сравнению с контролем. Ингибирующий эффект ниглизина сравниваютс анти-В ИЧ действием азидотимидина и 3-глицирризиновой кислоты - известных ингибиторов репродукции ВИЧ,Предлагаемое изобретение обладаетсущественными отличиями; т,к, авторами впервые установлена способность ниглизина ингибировать репродукцию ВИЧ (ВИЧи ВИЧ) в культуре клеток, не известная ранее. Приведенные ниже конкретные примеры подробно раскрывают сущность изобретения.П р и м е р 1. Изучение влияния пентаО-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) на репродукцию ВИЧв культуре клеток МТ..Суспензия инфицированных ВИЧклеток МТс концентрацией 5 х 10 клеток/мл в питательной среде ВРМТ - 1640. содержа 1804848щей 1 ОЯ, сыворотки плода коровы, 0,06глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую.Затем в контрольные лунки вносят по 2 мкл 5ДМСО, а в остальные лунки вносят по 2 мклраствора ниглизина в ДМСО с концентраци-.ями 100 мг/мл и 50 мг/мл до конечной концентрации ниглизина в культуральнойсреде, 1,0 мг/мл и 0,5 мг/мл, соответственно (берут не менее 3-х лунок на каждыйвариант), В несколько пустых лунок вносятдля контроля по 200 мкл суснензии неинфицированных клеток МТс концентрацией 5х 10 клеток/мл.15Планшет закрывают и инкубируют оовлажной камере СО-инкубатора с 5 О углекислого газа при температуре (36-37) С втечение 4-х суток.По окончании инкубации контролируют 20уровень вируспродукции иммуноферментным методом и методом определения активности обратной транскриптазы. Подготовкуобразцов для ИФА осуществляют инактиви- .руя ВИЧдобавлением к пробе твинадоконечной концентрации 0,1 Оь с последующей инкубацией при температуре (62:2)С вте,ение не менее 24 ч. Из приготовленныхтаким образом проб готовят ряд последовательных двукратных разведений, которые за,тем вносят попарно по(1 ООФ) мкл в лункисенсибилизировенных планшетовтест-системы "Вектор" или "АЬЬой", Дальнейшие операции и учет результатов проводят всоответствии с инсгрукцией по применению 35тест-системы, За титр вирусного энтигенапринимают то конечное разведение исходного матеоиала, в котором достоверно выявляется антиген ВИЧ. Ингибирующий.эффект оценивают по отношению титров вирусного антигена в исследуемой пробе иконтроле (без добавления препарата).Уровень вируспродукции оцениваюттакке по активности обратной транскриптазы, За активность обратной транскриптазы 45принимают включение радиоактивной метки в импульсах на 1 мл культуральной жидкости. Ингибирующий эффект оценивают поотношению эктлвности обратной транскриптазы в исследуемом образце и контроле (без давления препарата).Количество живых клеток в исследуемом образце и в контролях определяют спомощью камеры Горяева после окрашивания клеток 0,4-ным раствором трипанового синего, Результаты представлены втаблице 1,П р и м е р 2. Изучение влияния пентаО-никотината глици;ризиновой кислоты(ниглизина) на репродукцию ВИЧв культуре клеток ЭВК-ИРА/3,Суспензию хронически инфицированных ВИЧклеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 5,5 х 10 клеток/мл в питательнойсреде ВРМ 1-1640, содержащей 15 сыворотки плода коровы 0,06 глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой влунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Далее эксперимент проводят как описано в примере 1.Результаты эксперимента представлены втаблице 2.П р и м е р 3. Изучение влияния азидотимидина на репродукцию ВИЧв культуреклеток МТ.Суспензию инфицированных ВИЧ клеток МТс концентрацией 5,6 х 10 клеток/мл в среде ВРМ 1-1640, содержащей1000 сыворотки плода коровы, 0,06;6 глутамина, антибиотики, вносят автоматическойпипеткой по 180 мкл в каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Затем вконтрольные лунки вносят по 20 мкл ростовой питательной среды, а е остальные лункивносят по. 20 мкл раствора азидотими- .дина в питательной среде с концентрацией100 мкг/мл до конечной концентрации азидотимидина в культуральной среде 10 мкг/мл.Далее поступают так же, как описано впримере 1. Результаты приведены в таблице 1,П р и м е р 4. Изучение влияния азидотимидина на репродукцию ВИЧв культуреклеток ЭВК-ИРА/3.Суспензию хронически инфицированных ВИЧклеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 0,6. х 10 клеток/мл в питательнойсреде ВРМ 1-1640, содержащей 15 ф сыворотки коровы, 0,060 глутэминэ, антибио- .тики, вносят автоматической пипеткой по180 мкл в каждую лунку 96-луночного культурального планшета, Далее поступают также, как описано в примере 3. Результатывлияния Р-глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧв культуре клеток МТ.Суспензию инфицированных ВИЧ клеток МТс концентрацией 5 х 10 клеток/мл в питательной среде ВРМ 1-1640, содержащей 100/, сыворотки плода коровы,0,06% глутэмина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой влунки 96-луночногокультурального планшета по 200 мкл в. каждую, Затем в контрольные лунки вносят по2 мкл 96 этилового спирта, а в остальныелунки вносят по 2 мкл растворов ф-глицерризиновой кислоты в 96 этиловом спирте сконцентрациями 100 мг/мл и 50 мг/мл доконечной концентрации/3-глицерризиновойкислоты в культуральной жидкости 1,0 мг/мл и 0,5 мг/мл, соответственно. Далее поступают так же, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 1.П р и м е р 6. Изучение влияния ф-глицирриэиновой кислоты на репродукцию ВИЧв культуре клеток ЭВК-ИРА/3.Супензию хронически инфицированных ВИЧклеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 5,5 х 10 клеток/мл в питательной среде ВРМ 1-1640, содержащей 15 сыворотки плода коровы 0,06 глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Далее поступают так же, как описано в примере 5. Результаты представлены в таблице 2,П р и м е р 7. Изучение влияния пента- О-никотината глицирризиновой кислоты (ниглиэина) на репродукцию ВИЧ - 2 в культуре клеток,В эксперименте используют суспензию инфицированных ВИЧклеток МТ.с концентрацией 5 х 10 клеток/мл в питательной среде ВРМ, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06 ф 6 глутамина, антибиотики. Эксперимент проводят так же, как описано в примере 1, Иммуноферментный, анализ проводят с тест-системой "Вектор" с использованием антигена ВИЧ, коньюгата иммуноглобулинов с пероксидазой хрена, полученных из сыворотки крови больного, инфицированного ВИЧи положительной сыворотки крови, содержащей антитела к ВИЧ, Результаты приведены в таблице 1.П р и м е р 8. Изучение влияния азидотимидина на репродукцию ВИЧв культуре клеток.В эксперименте используют суспензию инфицированных ВИЧклеток МТс концентрацией 5,6 х 10 клеток/мл в питательной среде ВРМ 1-1640, содержащей 10 сыворотки плода коровы 0,06% глутамина, антибиотики, которую вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 180 мкл в каждую. Затем в контрольные лунки вносят по 20 мкл ростовой питательной среды, а в остальные лунки вносят по 20 мкл раствора азидотимидина в питательной среде с концентрацией 100 мкгlмл до конечной концентрации ази 20 дает ингибирующего эффекта. Приведен ные здесь экспериментальные данные убедительно показывают преимущества ниглизина по сравнению с азидотимидином(по токсичности) и с ф-глицирризиновой 25 30 кислотой (по ингибирующему эффекту на культуре хронически инфицированных ВИЧклеток).Таким образом, применение пента-О- никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) в качестве ингибитора ВИЧи ВИЧпозволяет расширить сгектр противовирусных препаратов для борьбы со СПИД. Наличие доступного отечественного 35 сырья и производственно-технологической базы в г, Уфе для производства ниглизина -.очень важное условие его изготовления, тогда как основное исходное соединение для синтеза азидотимидина тимидин (первона 40. чально получаемый из икры лосося и сельди) производится десятистадийным синтезом американской фирмой "Р 1 кег". и в целом период с момента получения сырья до изготовления препарата составляет около семи 45 месяцев.Формула изобретения Применение пента-О-никотината гиацирриэиновой кислоты в качестве вещества, проявляющегося свойства ингибитора размножения вируса иммунодефицита че 50 ловека дотимидина в культуральной среде 10 мкг/мл. Далее поступают так же, как описано в примере 7. Результаты представлены в таблице 1.5 Из таблиц видно, что ниглизин не уступает по эффективности ингибирования ВИЧазидотимидину и даже превосходит его по эффективности ингибирования ВИЧ в культуре клеток, при этом не оказывая 10 токсического действия на клетки. При сравнении ингибирующего эффекта ниглизина и глицирризиновой кислоты видно, что оба препарата эффективно ингибируют размножение вируса в первично инфициро ванной ВИЧкультуре клеток МТ,однако в хронически инфицированной ВИЧ культуре клеток ЭВК-ИРА/3 ниглизин на 60-62 подавляет репродукцию вируса, в то время как ф-глицирризиновая кислота не1804848 Таблица 1 Ингибировамие репродукции ВИЧи ВИЧв культуре клеток МТКонцентрация препарата мкг/мл ВИЧВИЧНаименование препаратаИнгибирование накопления вирусного энтигена,Количество живых клеток,Количество живых клеток,96,4 М,9 99,3+0,1 98,320,8 96,620,4 96;7+0,4 35,5 2,4 0 0 11,6: 2,8 49,4 ф 13,738,5+3,7 П ри меч а н и е. Средние значения оценены по критерию Стьюдента для Р 0,5; и/о - не определяли Таблица Ф Ингибировамие репродукции ВИЧи ВИЧв хронически инфицированной культуре клеток ЭВК-ИРА/3Концентрация препарата, мкг/мл Наименование препаратаКоличество живых кле.ток, ф Ингиби ование активности вирусной обратной транск иптаэы,накопления вирусного антигена,0 0 П р и м е ч а н и е. Средние значения оценемы по критерию Стьюдемтэ для Р,5; н/о - не определяли Составитель А, ПокровскийТехред М.Моргентал Корректор. Л, Филь Редактор Заказ 912 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат, "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101 Аэидотимидинф-глицирризиновая кислота НиглизинмКонтроль (инфицированные клетки)Контроль (неинфицировэнные клетки) 10 1000 500 1000 500